Изменить судьбу клетки
04.09.2008
5434
0
54340
Изменить судьбу клетки
(оригинальное название статьи: Smash the (Cell) State!)
После того, как была успешно проведена первая в мире операция клонирования, исследователи как одержимые принялись разрабатывать различные техники, позволяющие вернуть терминально дифференцированные клетки к ранним этапам развития. Недавние противоречащие догмам молекулярной биологии открытия, опубликованные в журнале Nature, требуют повторного рассмотрения истории этого вопроса.
Рождение овечки Долли в 1997 году явилось доказательством того, что цитоплазма яйцеклетки млекопитающих может репрограммировать ядро любой специализированной соматической клетки таким образом, что оно сможет дать начало ядру любой другой соматической клетки [1]. Через три года напряженной работы с помощью техники переноса ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) была клонирована первая линия эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), подтвердившая, что перенос ядра соматической клетки в ооцит полностью изменяет свойства этого ядра, и новая клонированная клетка обладает свойствами плюрипотентности и неограниченной пролиферации, как обычные эмбриональные клетки [2]. Немногим позже ЭСК были получены из нейронов и клеток крови, и после этого уже не осталось сомнений в том, что цитоплазматические факторы яйцеклетки могут полностью изменять процессы, происходящие в ядрах терминально дифференцированных клеток [3,4]. В то время идея, что такой же результат может быть получен без использования яйцеклеток, была практически немыслима, но с тех пор он была уже несколько раз блестяще реализована. С помощью внесения в клетку генов, кодирующих определенный набор транскрипционных факторов, различные типы клеток мыши, а также фибробласты человека были возвращены в «стволовое» состояние [5-8].
Естественно, исследователи в своем поиске специфических типов клеток для нужд регенеративной медицины стали задаваться вопросом, насколько вообще необходимы плюрипотентные клетки. Время ожидания в этом случае слишком велико: дифференцировка в условиях лаборатории плюрипотентной клетки, например, в нейрон, может занимать месяцы [9], а в некоторые другие клеточные типы – намного дольше. Возможно, существует гораздо более экономный метод трансдифференцировки одного типа соматических клеток в другой, минуя плюрипотентное состояние, чтобы эффективно и быстро обеспечивать пациентов необходимым клеточным материалом для лечения диабета, последствий инфарктов или болезни Паркинсона? Может ли дифференцированная клетка одной ткани быть репрограммирована таким образом, чтобы стать дифференцированной клеткой другой ткани?
Короткий путь к бета-клеткам
На конференции Международного Общества Исследований Стволовых Клеток (International Society for Stem Cell Research (ISSCR)) директор Гарвардского Института Стволовой Клетки (Harvard Stem Cell Institute) Дуг Мелтон (Doug Melton) рассказал об исследованиях, результаты которых указывают на возможность такого пути. Используя технику, схожую с той, что была применена для получения первых индуцированных плюрипотентных клеток (induced pluripotent stem (iPS) cells), научная группа под руководством коллеги Мелтона Ксяо Джу (Qiao Zhou) получила из экзокринных клеток поджелудочной железы, секретирующих пищеварительные ферменты, бета-клетки, продуцирующие инсулин. Последние составляют весьма небольшой процент клеток органа и их всегда недостаточно для трансплантаций пациентам, страдающим диабетом, в то время как на долю первых приходится до 95% массы железы. По этой причине получение одного из другого эквивалентно получению золота из угля.
Гарвардские исследователи проанализировали литературные данные по известным транскрипционным факторам, работающим в клетках мышей, последовательно сократив их число от 1400 известных до девяти, которые могли быть важны для поддержания функций бета-клеток. Использовав ретровирусы для доставки генов этих факторов в экзокринные клетки поджелудочной железы мыши, как говорит Мелтон, они «обнаружили новые инсулин-продуцирующие клетки вне их нормального расположения в так называемых островках Лангерганса».
«Эти клетки не «выглядели как…» и не «напоминали» бета-клетки. Они действительно были бета-клетками», утверждает Мелтон. В конце концов выяснилось, что такого результата можно добиться, внося в клетки только три гена транскрипционных факторов: Pdx1, Ngn3 и MafA. Клиническое применение этого открытия остается делом далекого будущего, и не только из-за генной терапии: дело в том, что полученные учеными клетки, по-видимому, не реагируют на изменения концентраций глюкозы. Тем не менее, когда мышам индуцировали диабет путем инъекций препарата, запускающего гибель бета-клеток, а после этого вносили в клетки их поджелудочной железы три указанных гена, в их организме начиналась продукция инсулина, что приводило к снижению уровня глюкозы в их крови.
Изменение судеб клеток
Эксперименты в лаборатории Мелтона не были первыми, в которых было продемонстрировано, что манипулирование геномом дифференцированной клетки может изменять ее качества: существуют более ранние работы, указывающие на возможность получения эндокринных клеток из экзокринных.
Возможно, самый известный пример относится к 1980м годам, когда Гарольд Вайнтрауб (Harold Weintraub) из Центра Исследований Рака Фреда Хатчинсона (Fred Hutchinson Cancer Center) в Сиэтле показал, что трансфекция фибробластоподобных клеток ДНК, кодирующей транскрипционный фактор MyoD, характерный для мышечных клеток, приводит к трансдифференцировке фибробластов в мышечные клетки [10]. Позже другие исследователи показали, что делеция либо деплеция одного транскрипционного фактора приводит к тому, что В-лимфоциты приобретают характеристики Т-клеток либо макрофагов, соответственно [11,12]. Но примерами могут послужить не только клетки крови и мышц. Гиперэкспрессия гена еще одного транскрипционного фактора может изменить путь дифференцировки нейрональных стволовых клеток, в результате чего они дают начало олигодендроцитам [13].
Но все эти конверсии имеют в своей основе единичные транскрипционные факторы, чье мощное влияние на состояние клеток уже было известно из исследований на мутантных клетках; работа, проведенная в лаборатории Мелтона по конверсии экзокринных клеток в бета-клетки – гораздо более серьезный шаг. Он основан на тройной трансфекции, результат которой очень сложно выявить в работах на мутантных клетках. «Нельзя получать мутации одновременно в трех генах», говорит Мелтон. Эксперименты в его лаборатории потребовали построения некоторых предположений и много удачи.
Те, кто ознакомились с открытиями группы Мелтона, которые вскоре будут опубликованы в Nature [14], называют их знаменательным шагом вперед. «Найти комбинацию, позволяющую запустить трансдифференцировку в многие клетки помимо бета-клеток и научиться восстанавливать их утраченные функции – это, думаю, было очень впечатляюще», говорит Кен Зарет (Ken Zaret), возглавляющий программу по эпигенетике и клеткам-предшественницам в Центре Исследований Рака Фокс Чейз (Fox Chase Cancer Center) в США, штате Пенсильвания.
Тем не менее, по мнению Роберта Тьяна (Robert Tjian), директора Центра Стволовой Клетки Калифорнийского Университета в Беркли (University of California, Berkeley's Stem Cell Center), «является экспериментом с черным ящиком. Вы берете этот черный ящик, бьете его изо всех сил молотком с одной стороны и что-то вылетает из него с другой. Но что происходит в этот момент внутри ящика – об этом вы не имеете никакого представления. Сколько этапов ускользает от вашего внимания?»
Транскрипция, специфичная для клеток
Низкая эффективность получения из фибробластов индуцированных плюрипотентных клеток (в количестве сотых и тысячных долей процента) и длительность этой процедуры (около месяца) указывают на то, что помимо транскрипционных факторов есть иные механизмы, ответственные за этот процесс. Многие из этих возможных регуляторов до сих пор не идентифицированы. Например, большинство РНК-транскриптов в клетках млекопитающих не кодирует никаких белков [15], и неизвестно, какие функции они выполняют (по-видимому, регуляторные).
Тьян выявил еще один регулятор определения судьбы клетки, по крайней мере, для мышечных клеток [16]. Он обнаружил, что по мере того, как клетка специализируется, происходят последовательные изменения в факторах, обеспечивающих процесс транскрипции – массивном, мультисубъединичном комплексе фермента РНК-полимеразы и других белков, которые раскручивают двойную спираль ДНК и синтезируют на основе кодирующей нити РНК-копию (матричную РНК).
Это стало совершенной неожиданностью даже для Тьяна, поскольку «транскрипционная машина» долгое время считалась неизменной и инвариантной относительно видов и клеточных типов. На ежегодной конференции в Лаборатории Колд Спринг Харбор (Cold Spring Harbor Laboratory) в Нью-Йорке Тьян сообщил о своем наблюдении, что по мере дифференцировки предшественницы мышечной клетки из быстро делящегося миобласта в терминально дифференцированную миофибриллу, происходят изменения в конформации и взаимном расположении субъединиц транскрипционной машины. Иными словами, когда клетка переходит в новое качество, в котором будут активироваться другие наборы генов, а иные будут подавлены, некоторые субъединицы перестают работать и отсоединяются от комплекса. Это изменение, считает Тьян, может оказывать сильное – и необратимое – влияние на экспрессию генов, стабилизируя состояние клеток. Это может, в свою очередь, частично объяснить, почему репрограммирование фибробластов в индуцированные плюрипотентные клетки столь неэффективно: техника репрограммирования привносит в клетку необходимые транскрипционные факторы, не обеспечивая их подходящей транскрипционной машиной.
На данный момент лучше, хотя и не полностью, известна работа ферментов – в основном ДНК-метилаз и гистон-модифицирующих ферментов – которые, присоединяя или отщепляя специфические химические группы (эпигенетические маркеры) от хроматина, стабильно активируют или подавляют транскрипцию генов. Например, два крупных белковых комплекса, которые называются Polycomb и Trithorax, конкурируют друг с другом за метилирование различных аминокислотных позиций в гистоновых белках, которые структурируют ДНК в хромосомах. Также каждый из этих комплексов может отщеплять метильные группы, присоединенные другим комплексом.
Непостоянные маркеры
В отсутствие отменяющих сигналов (например, со стороны транскрипционных факторов), эпигенетические маркеры передаются в ходе последовательных митотических делений. Без существования эпигенетической памяти, каждая делящаяся клетка не была бы способна выполнять функции, унаследованные от материнской клетки.
Некоторые эпигенетические маркеры остаются даже после «грубого» репрограммирования, вызванного переносом ядра. В экспериментах, результаты которых были опубликованы в 2008 году в журнале Nature Cell Biology, Рэй Кит Нг (Ray Kit Ng) и его коллега Джон Гордон (John Gurdon) из Кэмбриджского Университета (University of Cambridge) обнаружили конкретную область генома, ассоциированную с геном, высокоспецифично экспрессирующимся на ранних стадиях развития мышечных клеток, и сохраняющую «активный» набор эпигенетических меток [17]. Они также проследили экспрессию этого гена в эмбрионах, полученных после двух последовательных операций по переносу ядра соматической клетки в ооцит.
По-видимому, эпигенетические паттерны стабильны сами по себе и имеют стабилизирующий эффект, но все же не неизменны. В то время как эпигенетические маркеры поддерживают состояние клетки, транскрипционные факторы, чьи ДНК-специфические взаимодействия с хроматином определяют активацию эпигенетических маркеров, могут определять судьбу клеток.
«Модификация хроматина может ускорить процесс репрограммирования, но, по-видимому, специфика этого процесса зависит от ДНК-связавающих транскрипционных факторов», считает специалист по молекулярной биологии Рик Янг (Rick Young) из Института Уайтхэд в Кембридже (Whitehead Institute in Cambridge) штата Массачусетс, в США. Янг говорит, что «в нашем геноме закодировано около 1500 подобных факторов – это составляет 7% нашей кодирующей ДНК». Естественно, после того, как будут выяснены взаимодействия различных транскрипционных факторов, изменяющих и поддерживающих состояние клетки, в работе по трансдифференцировке одних клеточных типов в другие останется меньше места для догадок и предположений.
Но даже процесс дифференцировки в норме весьма туманен. Существует не так много досконально изученных программ дифференцировки клеток in vitro от ЭСК до дифференцированных клеток, которые могут в перспективе быть полезны для клеточной терапии, как указывает Янг. Как бы то ни было, транскрипционные факторы, участвующие в этих процессах, хорошо известны по крайней мере для одного типа клеток – моторных нейронов [18], и в лабораториях Янга, Зарета и Тьяна в настоящее время ведутся работы над другими клеточными линиями, такие как гепатоциты, дофаминэргические нейроны, миоциты скелетной и сердечной мускулатуры.
Больше, чем идентификация
В анализе судьбы клетки имеет значение не только идентификация ключевых транскрипционных факторов. Знание о том, какое количество транскрипционного фактора и в какой момент клеточного цикла должно вступить в процесс, также очень важно. Игорь Лемичка (Ihor Lemischka), директор Института Стволовой Клетки Блэк Фэмили (Black Family Stem Cell Institute) в Нью-Йорке, отмечает, что добавление одних и тех же транскрипционных факторов в трех различных соотношениях приводит к получению трех различных типов дифференцированных клеток [19].
Существуют ли какие-то принципиальные ограничения в репрограммировании? «Я не знаю, насколько это будет сложно», говорит Лемичка, «сегодня можно сказать, что некоторые успешные случаи получения из Клетки-А Клетки-Б, несмотря на их интересность, не могут расцениваться как получение клеток, неотличимых от их естественных аналогов».
В то время как возвращение фибробластов кожи в плюрипотентное состояние крайней малоэффективно и требует недель культивирования in vitro, трансдифференцировка экзокринных клеток поджелудочной железы в бета-клетки – процесс гораздо более быстрый и эффективный. Он занимает меньше недели и при этом около 20% трансфецированных клеток становятся функциональными бета-клетками. Даже если экспрессия внесенного вирусного вектора прекращается в течение месяца, ее эффект сохраняется больше шести месяцев и может оставаться постоянным – Мелтон считает, что уверенно говорить об этом пока рано.
Успех с конверсией инсулин-продуцирующих клеток натолкнул Мелтона на мысли о схожих экспериментах по конверсиям клеток других органов, например, мозга. При некоторых нейродегенеративных расстройствах, говорит Мелтон, «нейроны разрушаются, в то время как соседние поддерживающие клетки – астроциты и глия – остаются совершенно здоровыми». В дополнение к этому, он заявляет: «печень человека прекрасно регенерирует. Если мы сможем получить бета-клетки из гепатоцитов, это будет настоящим прорывом».
Параллельно с исследованиями, Мелтон и многие другие ученые борются с другой проблемой, которая должна быть решена прежде чем какие-либо искусственно трансдифференцированные клетки будут доступны для клинического применения: случайным встраиванием ретровирусов, используемых для трансфекции, в геном клетки-реципиента, создавая химерные и потенциально онкогенные ДНК. Исследователи уверены, что решение этой проблемы – путем создания небольших молекул, аналогичных транскрипционным факторам, или генерирования внеклеточных сигналов, модулирующих их активность – рано или поздно будет найдено.
Литература:
1. Wilmut, I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810–813 (1997).
2. Munsie, M. J. et al. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. Curr. Biol. 10, 989–992 (2000).
3. Hochedlinger, K. & Jaenisch, R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature 415, 1035–1038 (2002).
4. Eggan, K. et al. Mice cloned from olfactory sensory neurons. Nature 428, 44–49 (2004).
5. Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663–676 (2006).
6. Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861–872 (2007).
7. Yu, J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917–1920 (2007).
8. Hanna, J. et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell 133, 250–264 (2008).
9. Li, X.-J. et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 23, 215–221 (2005).
10. Weintraub, H. et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86, 5434–5438 (1989).
11. Cobaleda, C., Jochum, W. & Busslinger, M. Conversion of mature B cells into T cells by dedifferentiation to uncommitted progenitors. Nature 449, 473–479 (2007).
12. Xie, H., Ye, M., Feng, R. & Graf, T. Stepwise reprogramming of B cells into macrophages. Cell 117, 663–676 (2004).
13. Jessberger, S., Toni, N., Clemenson, G. D. Jr., Ray, J. & Gage, F. H. Directed differentiation of hippocampal stem/progenitor cells in the adult brain. Nature Neurosci. 11, 888–893 (2008).
14. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J. & Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to bold beta-cells. Nature advance online publication 27 August 2008.doi: 10.1038/nature07314
15. Mattick, J. S. Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-coding RNAs in complex organisms. BioEssays 25, 930–939 (2003).
16. Deato, M. D. E. & Tjian, R. Switching of the core transcription machinery during myogenesis. Genes Dev. 21, 2137–2149 (2007).
17. Ng, R. K. & Gurdon, J. B. Epigenetic memory of an active gene state depends on histone H3.3 incorporation into chromatin in the absence of transcription. Nature Cell Biol. 10, 102–109 (2008).
18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A. & Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell 110, 385–397 (2002).
19. Niwa, H., Miyazaki, J. & Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genet. 24, 372–376 (2000).
Текст: Bruce Goldman
По материалам:
Nature News
(оригинальное название статьи: Smash the (Cell) State!)
После того, как была успешно проведена первая в мире операция клонирования, исследователи как одержимые принялись разрабатывать различные техники, позволяющие вернуть терминально дифференцированные клетки к ранним этапам развития. Недавние противоречащие догмам молекулярной биологии открытия, опубликованные в журнале Nature, требуют повторного рассмотрения истории этого вопроса.
Рождение овечки Долли в 1997 году явилось доказательством того, что цитоплазма яйцеклетки млекопитающих может репрограммировать ядро любой специализированной соматической клетки таким образом, что оно сможет дать начало ядру любой другой соматической клетки [1]. Через три года напряженной работы с помощью техники переноса ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) была клонирована первая линия эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), подтвердившая, что перенос ядра соматической клетки в ооцит полностью изменяет свойства этого ядра, и новая клонированная клетка обладает свойствами плюрипотентности и неограниченной пролиферации, как обычные эмбриональные клетки [2]. Немногим позже ЭСК были получены из нейронов и клеток крови, и после этого уже не осталось сомнений в том, что цитоплазматические факторы яйцеклетки могут полностью изменять процессы, происходящие в ядрах терминально дифференцированных клеток [3,4]. В то время идея, что такой же результат может быть получен без использования яйцеклеток, была практически немыслима, но с тех пор он была уже несколько раз блестяще реализована. С помощью внесения в клетку генов, кодирующих определенный набор транскрипционных факторов, различные типы клеток мыши, а также фибробласты человека были возвращены в «стволовое» состояние [5-8].
Естественно, исследователи в своем поиске специфических типов клеток для нужд регенеративной медицины стали задаваться вопросом, насколько вообще необходимы плюрипотентные клетки. Время ожидания в этом случае слишком велико: дифференцировка в условиях лаборатории плюрипотентной клетки, например, в нейрон, может занимать месяцы [9], а в некоторые другие клеточные типы – намного дольше. Возможно, существует гораздо более экономный метод трансдифференцировки одного типа соматических клеток в другой, минуя плюрипотентное состояние, чтобы эффективно и быстро обеспечивать пациентов необходимым клеточным материалом для лечения диабета, последствий инфарктов или болезни Паркинсона? Может ли дифференцированная клетка одной ткани быть репрограммирована таким образом, чтобы стать дифференцированной клеткой другой ткани?
Короткий путь к бета-клеткам
На конференции Международного Общества Исследований Стволовых Клеток (International Society for Stem Cell Research (ISSCR)) директор Гарвардского Института Стволовой Клетки (Harvard Stem Cell Institute) Дуг Мелтон (Doug Melton) рассказал об исследованиях, результаты которых указывают на возможность такого пути. Используя технику, схожую с той, что была применена для получения первых индуцированных плюрипотентных клеток (induced pluripotent stem (iPS) cells), научная группа под руководством коллеги Мелтона Ксяо Джу (Qiao Zhou) получила из экзокринных клеток поджелудочной железы, секретирующих пищеварительные ферменты, бета-клетки, продуцирующие инсулин. Последние составляют весьма небольшой процент клеток органа и их всегда недостаточно для трансплантаций пациентам, страдающим диабетом, в то время как на долю первых приходится до 95% массы железы. По этой причине получение одного из другого эквивалентно получению золота из угля.
Гарвардские исследователи проанализировали литературные данные по известным транскрипционным факторам, работающим в клетках мышей, последовательно сократив их число от 1400 известных до девяти, которые могли быть важны для поддержания функций бета-клеток. Использовав ретровирусы для доставки генов этих факторов в экзокринные клетки поджелудочной железы мыши, как говорит Мелтон, они «обнаружили новые инсулин-продуцирующие клетки вне их нормального расположения в так называемых островках Лангерганса».
«Эти клетки не «выглядели как…» и не «напоминали» бета-клетки. Они действительно были бета-клетками», утверждает Мелтон. В конце концов выяснилось, что такого результата можно добиться, внося в клетки только три гена транскрипционных факторов: Pdx1, Ngn3 и MafA. Клиническое применение этого открытия остается делом далекого будущего, и не только из-за генной терапии: дело в том, что полученные учеными клетки, по-видимому, не реагируют на изменения концентраций глюкозы. Тем не менее, когда мышам индуцировали диабет путем инъекций препарата, запускающего гибель бета-клеток, а после этого вносили в клетки их поджелудочной железы три указанных гена, в их организме начиналась продукция инсулина, что приводило к снижению уровня глюкозы в их крови.
Изменение судеб клеток
Эксперименты в лаборатории Мелтона не были первыми, в которых было продемонстрировано, что манипулирование геномом дифференцированной клетки может изменять ее качества: существуют более ранние работы, указывающие на возможность получения эндокринных клеток из экзокринных.
Возможно, самый известный пример относится к 1980м годам, когда Гарольд Вайнтрауб (Harold Weintraub) из Центра Исследований Рака Фреда Хатчинсона (Fred Hutchinson Cancer Center) в Сиэтле показал, что трансфекция фибробластоподобных клеток ДНК, кодирующей транскрипционный фактор MyoD, характерный для мышечных клеток, приводит к трансдифференцировке фибробластов в мышечные клетки [10]. Позже другие исследователи показали, что делеция либо деплеция одного транскрипционного фактора приводит к тому, что В-лимфоциты приобретают характеристики Т-клеток либо макрофагов, соответственно [11,12]. Но примерами могут послужить не только клетки крови и мышц. Гиперэкспрессия гена еще одного транскрипционного фактора может изменить путь дифференцировки нейрональных стволовых клеток, в результате чего они дают начало олигодендроцитам [13].
Но все эти конверсии имеют в своей основе единичные транскрипционные факторы, чье мощное влияние на состояние клеток уже было известно из исследований на мутантных клетках; работа, проведенная в лаборатории Мелтона по конверсии экзокринных клеток в бета-клетки – гораздо более серьезный шаг. Он основан на тройной трансфекции, результат которой очень сложно выявить в работах на мутантных клетках. «Нельзя получать мутации одновременно в трех генах», говорит Мелтон. Эксперименты в его лаборатории потребовали построения некоторых предположений и много удачи.
Те, кто ознакомились с открытиями группы Мелтона, которые вскоре будут опубликованы в Nature [14], называют их знаменательным шагом вперед. «Найти комбинацию, позволяющую запустить трансдифференцировку в многие клетки помимо бета-клеток и научиться восстанавливать их утраченные функции – это, думаю, было очень впечатляюще», говорит Кен Зарет (Ken Zaret), возглавляющий программу по эпигенетике и клеткам-предшественницам в Центре Исследований Рака Фокс Чейз (Fox Chase Cancer Center) в США, штате Пенсильвания.
Тем не менее, по мнению Роберта Тьяна (Robert Tjian), директора Центра Стволовой Клетки Калифорнийского Университета в Беркли (University of California, Berkeley's Stem Cell Center), «является экспериментом с черным ящиком. Вы берете этот черный ящик, бьете его изо всех сил молотком с одной стороны и что-то вылетает из него с другой. Но что происходит в этот момент внутри ящика – об этом вы не имеете никакого представления. Сколько этапов ускользает от вашего внимания?»
Транскрипция, специфичная для клеток
Низкая эффективность получения из фибробластов индуцированных плюрипотентных клеток (в количестве сотых и тысячных долей процента) и длительность этой процедуры (около месяца) указывают на то, что помимо транскрипционных факторов есть иные механизмы, ответственные за этот процесс. Многие из этих возможных регуляторов до сих пор не идентифицированы. Например, большинство РНК-транскриптов в клетках млекопитающих не кодирует никаких белков [15], и неизвестно, какие функции они выполняют (по-видимому, регуляторные).
Тьян выявил еще один регулятор определения судьбы клетки, по крайней мере, для мышечных клеток [16]. Он обнаружил, что по мере того, как клетка специализируется, происходят последовательные изменения в факторах, обеспечивающих процесс транскрипции – массивном, мультисубъединичном комплексе фермента РНК-полимеразы и других белков, которые раскручивают двойную спираль ДНК и синтезируют на основе кодирующей нити РНК-копию (матричную РНК).
Это стало совершенной неожиданностью даже для Тьяна, поскольку «транскрипционная машина» долгое время считалась неизменной и инвариантной относительно видов и клеточных типов. На ежегодной конференции в Лаборатории Колд Спринг Харбор (Cold Spring Harbor Laboratory) в Нью-Йорке Тьян сообщил о своем наблюдении, что по мере дифференцировки предшественницы мышечной клетки из быстро делящегося миобласта в терминально дифференцированную миофибриллу, происходят изменения в конформации и взаимном расположении субъединиц транскрипционной машины. Иными словами, когда клетка переходит в новое качество, в котором будут активироваться другие наборы генов, а иные будут подавлены, некоторые субъединицы перестают работать и отсоединяются от комплекса. Это изменение, считает Тьян, может оказывать сильное – и необратимое – влияние на экспрессию генов, стабилизируя состояние клеток. Это может, в свою очередь, частично объяснить, почему репрограммирование фибробластов в индуцированные плюрипотентные клетки столь неэффективно: техника репрограммирования привносит в клетку необходимые транскрипционные факторы, не обеспечивая их подходящей транскрипционной машиной.
На данный момент лучше, хотя и не полностью, известна работа ферментов – в основном ДНК-метилаз и гистон-модифицирующих ферментов – которые, присоединяя или отщепляя специфические химические группы (эпигенетические маркеры) от хроматина, стабильно активируют или подавляют транскрипцию генов. Например, два крупных белковых комплекса, которые называются Polycomb и Trithorax, конкурируют друг с другом за метилирование различных аминокислотных позиций в гистоновых белках, которые структурируют ДНК в хромосомах. Также каждый из этих комплексов может отщеплять метильные группы, присоединенные другим комплексом.
Непостоянные маркеры
В отсутствие отменяющих сигналов (например, со стороны транскрипционных факторов), эпигенетические маркеры передаются в ходе последовательных митотических делений. Без существования эпигенетической памяти, каждая делящаяся клетка не была бы способна выполнять функции, унаследованные от материнской клетки.
Некоторые эпигенетические маркеры остаются даже после «грубого» репрограммирования, вызванного переносом ядра. В экспериментах, результаты которых были опубликованы в 2008 году в журнале Nature Cell Biology, Рэй Кит Нг (Ray Kit Ng) и его коллега Джон Гордон (John Gurdon) из Кэмбриджского Университета (University of Cambridge) обнаружили конкретную область генома, ассоциированную с геном, высокоспецифично экспрессирующимся на ранних стадиях развития мышечных клеток, и сохраняющую «активный» набор эпигенетических меток [17]. Они также проследили экспрессию этого гена в эмбрионах, полученных после двух последовательных операций по переносу ядра соматической клетки в ооцит.
По-видимому, эпигенетические паттерны стабильны сами по себе и имеют стабилизирующий эффект, но все же не неизменны. В то время как эпигенетические маркеры поддерживают состояние клетки, транскрипционные факторы, чьи ДНК-специфические взаимодействия с хроматином определяют активацию эпигенетических маркеров, могут определять судьбу клеток.
«Модификация хроматина может ускорить процесс репрограммирования, но, по-видимому, специфика этого процесса зависит от ДНК-связавающих транскрипционных факторов», считает специалист по молекулярной биологии Рик Янг (Rick Young) из Института Уайтхэд в Кембридже (Whitehead Institute in Cambridge) штата Массачусетс, в США. Янг говорит, что «в нашем геноме закодировано около 1500 подобных факторов – это составляет 7% нашей кодирующей ДНК». Естественно, после того, как будут выяснены взаимодействия различных транскрипционных факторов, изменяющих и поддерживающих состояние клетки, в работе по трансдифференцировке одних клеточных типов в другие останется меньше места для догадок и предположений.
Но даже процесс дифференцировки в норме весьма туманен. Существует не так много досконально изученных программ дифференцировки клеток in vitro от ЭСК до дифференцированных клеток, которые могут в перспективе быть полезны для клеточной терапии, как указывает Янг. Как бы то ни было, транскрипционные факторы, участвующие в этих процессах, хорошо известны по крайней мере для одного типа клеток – моторных нейронов [18], и в лабораториях Янга, Зарета и Тьяна в настоящее время ведутся работы над другими клеточными линиями, такие как гепатоциты, дофаминэргические нейроны, миоциты скелетной и сердечной мускулатуры.
Больше, чем идентификация
В анализе судьбы клетки имеет значение не только идентификация ключевых транскрипционных факторов. Знание о том, какое количество транскрипционного фактора и в какой момент клеточного цикла должно вступить в процесс, также очень важно. Игорь Лемичка (Ihor Lemischka), директор Института Стволовой Клетки Блэк Фэмили (Black Family Stem Cell Institute) в Нью-Йорке, отмечает, что добавление одних и тех же транскрипционных факторов в трех различных соотношениях приводит к получению трех различных типов дифференцированных клеток [19].
Существуют ли какие-то принципиальные ограничения в репрограммировании? «Я не знаю, насколько это будет сложно», говорит Лемичка, «сегодня можно сказать, что некоторые успешные случаи получения из Клетки-А Клетки-Б, несмотря на их интересность, не могут расцениваться как получение клеток, неотличимых от их естественных аналогов».
В то время как возвращение фибробластов кожи в плюрипотентное состояние крайней малоэффективно и требует недель культивирования in vitro, трансдифференцировка экзокринных клеток поджелудочной железы в бета-клетки – процесс гораздо более быстрый и эффективный. Он занимает меньше недели и при этом около 20% трансфецированных клеток становятся функциональными бета-клетками. Даже если экспрессия внесенного вирусного вектора прекращается в течение месяца, ее эффект сохраняется больше шести месяцев и может оставаться постоянным – Мелтон считает, что уверенно говорить об этом пока рано.
Успех с конверсией инсулин-продуцирующих клеток натолкнул Мелтона на мысли о схожих экспериментах по конверсиям клеток других органов, например, мозга. При некоторых нейродегенеративных расстройствах, говорит Мелтон, «нейроны разрушаются, в то время как соседние поддерживающие клетки – астроциты и глия – остаются совершенно здоровыми». В дополнение к этому, он заявляет: «печень человека прекрасно регенерирует. Если мы сможем получить бета-клетки из гепатоцитов, это будет настоящим прорывом».
Параллельно с исследованиями, Мелтон и многие другие ученые борются с другой проблемой, которая должна быть решена прежде чем какие-либо искусственно трансдифференцированные клетки будут доступны для клинического применения: случайным встраиванием ретровирусов, используемых для трансфекции, в геном клетки-реципиента, создавая химерные и потенциально онкогенные ДНК. Исследователи уверены, что решение этой проблемы – путем создания небольших молекул, аналогичных транскрипционным факторам, или генерирования внеклеточных сигналов, модулирующих их активность – рано или поздно будет найдено.
Литература:
1. Wilmut, I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810–813 (1997).
2. Munsie, M. J. et al. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. Curr. Biol. 10, 989–992 (2000).
3. Hochedlinger, K. & Jaenisch, R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature 415, 1035–1038 (2002).
4. Eggan, K. et al. Mice cloned from olfactory sensory neurons. Nature 428, 44–49 (2004).
5. Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663–676 (2006).
6. Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861–872 (2007).
7. Yu, J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917–1920 (2007).
8. Hanna, J. et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell 133, 250–264 (2008).
9. Li, X.-J. et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 23, 215–221 (2005).
10. Weintraub, H. et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86, 5434–5438 (1989).
11. Cobaleda, C., Jochum, W. & Busslinger, M. Conversion of mature B cells into T cells by dedifferentiation to uncommitted progenitors. Nature 449, 473–479 (2007).
12. Xie, H., Ye, M., Feng, R. & Graf, T. Stepwise reprogramming of B cells into macrophages. Cell 117, 663–676 (2004).
13. Jessberger, S., Toni, N., Clemenson, G. D. Jr., Ray, J. & Gage, F. H. Directed differentiation of hippocampal stem/progenitor cells in the adult brain. Nature Neurosci. 11, 888–893 (2008).
14. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J. & Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to bold beta-cells. Nature advance online publication 27 August 2008.doi: 10.1038/nature07314
15. Mattick, J. S. Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-coding RNAs in complex organisms. BioEssays 25, 930–939 (2003).
16. Deato, M. D. E. & Tjian, R. Switching of the core transcription machinery during myogenesis. Genes Dev. 21, 2137–2149 (2007).
17. Ng, R. K. & Gurdon, J. B. Epigenetic memory of an active gene state depends on histone H3.3 incorporation into chromatin in the absence of transcription. Nature Cell Biol. 10, 102–109 (2008).
18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A. & Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell 110, 385–397 (2002).
19. Niwa, H., Miyazaki, J. & Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genet. 24, 372–376 (2000).
Текст: Bruce Goldman
По материалам:
Nature News
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Последние комментарии
