РНК-интерференция в терапии рака. Часть 2.

Эволюция понимания функций РНК

До полного понимания роли молекул рибонуклеиновой кислоты в клетке учеными был проделан долгий путь. Гипотеза о значении РНК в синтезе белков была высказана еще в 1939 г.Торбъёрном Касперссоном (Torbjörn Caspersson) на основе исследований, в результате которых было показано, что клетки, активно синтезирующие белок, содержат большое количество РНК. Подтверждение гипотезы было получено Юбером Шантренне (Hubert Chantrenne). Исследователь Северо Очоа (Severo Ochoa) получил Нобелевскую премию по медицине в 1959 г.за открытие механизма синтеза РНК. Последовательность из 77 нуклеотидов одной из транспортных РНК дрожжей S.cerevisiae была определена в 1965 г.в лаборатории Роберта Холли (Robert Holley), за что в 1968 г.он получил Нобелевскую премию по медицине. В 1967 Карл Везе (Carl Woese) предположил, что РНК обладают каталитическими свойствами. Он выдвинул так называемую «гипотезу РНК-мира», в котором РНК прото-организмов служила и в качестве молекулы хранения информации (сейчас эта роль выполняется в основном ДНК), и в качестве молекулы, которая катализировала метаболические реакции (сейчас это делают в основном ферменты).

Открытие механизма РНК-интерференции и связанных с ним молекул миРНК и микроРНК еще более расширило спектр известных функций молекул рибонуклеиновой кислоты.

Механизм РНК-интерференции

Цель процесса РНК-интерференции состоит в специфическом расщеплении молекулы матричной РНК (мРНК). Исторически РНК-интерференция была известна под названием «посттранскрипционного сайленсинга генов», осуществляемого посредством реорганизации хроматина. Процесс РНК-интерференции начинается с двуцепочечной РНК. Двуцепочечные молекулы РНК (дцРНК) не характерны для нормальных клеток, но они являются обязательным этапом жизненного цикла многих вирусов. Специальный белковый комплекс Dicer, обнаружив в клетке дцРНК, «режет» ее на небольшие фрагменты. Антисмысловая цепь такого фрагмента, которую уже можно называть миРНК, связывается комплексом белков под названием RISC (RNA-induced silencing complex), центральный элемент которого – эндонуклеаза, принадлежащая к семейству белков Argonaute (Ago). Связывание с миРНК активирует RISC и запускает в клетке поиск молекул ДНК и РНК, комплементарных «шаблонной» миРНК. Судьба таких молекул – быть уничтоженными или инактивированными белковым комплексом RISC. Таким образом, короткие «обрезки» чужеродной (в том числе введенной намеренно) дцРНК служат «шаблоном» для широкомасштабного поиска и уничтожения комплементарных мРНК (а это эквивалентно подавлению экспрессии соответствующего гена), – причем, не только в одной клетке, но и в соседних. Для многих организмов – простейших, моллюсков, червей, насекомых, растений – этот феномен является одним из основных способов иммунной защиты против инфекций.

Как уже упоминалось выше, микроРНК, в отличие от миРНК, не производятся из чужеродных дцРНК, а изначально закодированы в геноме организма (Bartel et al., 2004). Молекулярный предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II, в результате чего появляется промежуточная форма – при-микроРНК, несущая признаки обычной мРНК, – специальный модифицированный нуклеотид (кэп) на 5’ конце молекулы и полиадениновый «хвост» на 3’ конце молекулы. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре. Такая петля (шпилька) подвергается двухстадийному процессингу: вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму клетки, где узнается Dicer’ом, вносящим еще два разреза (вырезается двуцепочечный участок). В таком виде зрелая микроРНК, аналогично миРНК, включается в состав белкового комплекса RISC. Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию миРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3’-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность других микроРНК (по сравнению с миРНК) уже более дифференцирована – если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не разрушаться, а только обратимо блокироваться.

Возможные мишени системы РНК-интерференции для противораковой терапии

Для сравнения раковых клеток со здоровыми всегда применялись разнообразные экспериментальные методы. Точковые мутации (замена 1 нуклеотида в генетической последовательности), приводящие к изменению функционирования онкогенов и генов опухолевой супрессии, происходят в процессе онкогенеза довольно часто. Например, мутации гена р53 обнаруживаются в клетках около 50% раковых опухолей. Белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим клеточный цикл. В норме он выполняет функцию подавления образования злокачественных опухолей. Зачастую его называют «стражем генома».

Синтетические миРНК являются высокоспецифичными и способны различать 1-нуклеотидные замены. Мартинес (Martines et al., 2002) в своих экспериментах продемонстрировал, что 1-нуклеотидные замены в молекулах миРНК отличают мутантные последовательности р53 от нормальных последовательностей в клетках, экспрессирующих обе аллели гена, что способствует восстановлению функций белка. Следовательно, миРНК можно использовать для подавления экспрессии генов даже с точковыми мутациями, что обеспечивает надежную базу для разработки персонализированной противораковой терапии.

Белки семейства Bcl-2, вовлеченные в регуляцию апоптоза и деления клеток, также часто оказываются ассоциированными с озлокачествлением клеток. Лин (Lin et al., 2001) в своих экспериментах доказал эффективность РНК-интерференции для подавления экспрессии мутантных генов bcl в клетках рака предстательной железы человека.

Белок c-Myc, являющийся транскрипционным фактором, регулирует экспрессию до 15% всех генов человека. Мутантные версии гена c-Myc обнаружены во многих опухолях, в том числе в большинстве опухолей молочной железы. При этом ген экспрессируется постоянно, что приводит к нарушению регуляции многих генов, в том числе, отвечающих за деление клеток. В 2005 г. И-Хуа Вангом (Yi-Hua Wang et al., 2005) было показано, что подавление экспрессии мутантного гена c-Myc с помощью РНК-интерференции приводило к остановке роста опухоли как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Таким образом, терапия, основанная на использовании механизма РНК-интерференции с целью подавления экспрессии мутантных онкогенов, таких как c-Myc, может иметь большой успех при лечении рака.

Одним из главных недостатков процедуры химиотерапии, применяемой для лечения рака, является ее токсичность для костного мозга. Известно, что отдельные субпопуляции раковых клеток устойчивы к определенным химиотерапевтическим агентам, из-за чего опухоли продолжают расти и после химиотерапии. Их клетки содержат специфические гены, обусловливающие устойчивость к химиотерапевтическим препаратам. Одним из таких генов является MDR1 – ген множественной лекарственной устойчивости, определяющий резистентность к некоторым алкалоидам (винбластин, винкристин), антрациклинам (адриамицин, даунорибуцин) и другим препаратам. В 2003 г. Нит (Nieth et al., 2003) продемонстрировал успешное подавление экспрессии гена MDR1 с помощью РНК-интерференции, что приводило к восстановлению чувствительности клеток к лекарственным препаратам.

В нескольких исследованиях было также показано, что подавление активности гена VEGF (Vascular endothelial growth factor, фактор роста сосудистого эндотелия) или же блокировка функционирования его рецепторов приводит к подавлению роста опухолей и распространения метастазов (Haper et al., 2005; Jocelyn et al., 2002). Разработка системы РНК-интерференции, ориентированной на конкретные молекулы VEGF, может иметь успех в противораковой терапии.

Теломеразы представляют собой еще одну привлекательную молекулярную мишень для противораковой терапии. В обычных соматически клетках организма теломераза не работает, однако ее активность обнаруживается в клетках 85% злокачественных опухолей. Считается, что активация теломеразы является одним из событий на пути клетки к злокачественному перерождению. В 2003 г. Косциолек (Kosciolek et al., 2003) экспериментально показал, что миРНК способны эффективно подавлять теломеразную активность раковых клеток человека.

Таким образом, во множестве экспериментов было продемонстрировано успешное использование молекул миРНК для подавления экспрессии мутантных онкогенов, таких как K-Ras (Brummelkamp, 2002), мутантный p53 (Martinez, 2002), гены Her2/neu (Chouldhury, 2004) и bcr-abl (Scherr, 2003). Эти данные – весьма перспективная основа для разработки эффективной противораковой терапии (Aza-Blance et al., 2003, Terwari M et al., 2003).