Инструменты биотехнологии: как работают гены

Начало брошюры см. здесь.

Изучение функций генов

Описанные выше клеточные процессы – рост, деление, дифференцировка, апоптоз, а также многие другие обеспечиваются и управляются с помощью белков. Белки являются молекулами, непрерывно стимулирующими и регулирующими каждый шаг любого протекающего в клетке процесса.

Детальное понимание процессов, протекающих в клетках здорового организма, а также при различных заболеваниях, равносильно пониманию механизмов функционирования белков. Так как гены содержат информацию, необходимую для синтеза белков, понимание процессов функционирования генов необходимо для понимания функционирования белков. Биотехнологические методы обеспечивают исследователей огромным разнообразием возможностей для изучения функций генов. Ниже мы приводим только некоторые из биотехнологических приемов, используемых учеными для изучения генетических основ жизнедеятельности клетки.

Молекулярное клонирование

Если устроить голосование по поводу самого важного биотехнологического исследовательского метода, скорее всего, выиграло бы молекулярное клонирование. Прямо или косвенно, но молекулярное клонирование явилось движущей силой биотехнологической революции и постепенно превратило выдающиеся открытия в рутинную практику. Применение этого метода сделало возможным идентификацию, локализацию и описание генов, создание генетических карт и секвенирование целых геномов, проведение параллелей между генами и характеристиками организма и определение молекулярных основ этих характеристик.

Молекулярное клонирование заключается во встраивании в бактериальную клетку нового участка ДНК таким образом, который обеспечивает его репликацию (воспроизведение) и изучение. Для поддержания целостности такого фрагмента он встраивается в характерную для бактерий кольцевую молекулу ДНК – плазмиду, которая защищает его от воздействия разрушающих ДНК ферментов, содержащихся в цитоплазме всех клеток. Так как в этом случае фрагмент ДНК встроен (рекомбинирован) в плазмиду, молекулярное клонирование представляет собой один из типов технологии рекомбинантных ДНК.

Новая ДНК, являющаяся частью рекомбинантной молекулы, реплицируется при каждом делении клетки. В молекулярном клонировании слово клон применяется по отношению к встроенному фрагменту ДНК, содержащей его плазмиде и популяции клеток или организмов, таких как бактерии, содержащих плазмиду с новым фрагментом ДНК. В процессе деления клеток происходит увеличение количества (амплификация) изучаемого участка ДНК, что обеспечивает исследователей практически неограниченным количеством его копий, доступных для различных манипуляций и изучения.

Кроме получения большого количества идентичных копий участка ДНК, молекулярное клонирование позволяет специалистам разделять геномы на фрагменты, пригодные к дальнейшей обработке. Даже самый простой геном (весь набор генетического материала организма) слишком объемен для изучения отдельных входящих в его состав генов. Для создания поддающихся изучению отрезков генетического материала ученые разделяют геномы на тысячи кусочков и встраивают их в разные клетки. Набор клеток, содержащих части целого генома одного организма, называется библиотекой ДНК. Так как идентификация и картирование генов основывается на использовании библиотек ДНК, термин «клонирование гена» может означать его идентификацию и картирование.

Одним из важнейших применений молекулярного клонирования является идентификация белка, закодированного в определенном гене, и сопоставление белка с проявлением определенного признака. Для получения ответов на некоторые вопросы необходимо учитывать, что гены не функционируют изолированно друг от друга. Для полного понимания функции каждого гена необходимо проследить за одновременной активностью множества генов. Это достигается с помощью технологии микрочипов.

Технология микрочипов

Технология микрочипов позволяет наблюдать экспрессию сотен и даже тысяч генов одновременно. (Экспрессия гена – это реализация закодированной в ДНК информации: копирование ее на информационную РНК и в конечном итоге синтез соответсвующего белка.) Недавно с помощью микрочипа, содержащего 12000 генов, исследователям удалось идентифицировать около 200 генов, уровень экспрессии которых отличает стволовые клетки от дифференцированных.

Мониторинг одновременного изменения функций различных генов может пролить свет на многие фундаментальные вопросы биологии. Например, исследователи используют микрочипы для наблюдения за изменениями генной активности при злокачественном перерождении нормальных клеток. Кроме выявления возможных причин развития рака, с помощью таких экспериментов могут быть выявлены гены, подающие сигнал к началу деления клетки.

Микрочипы, содержащие различные типы клеток, позволяют определять, активность каких генов характерна для каждой определенной ткани. Знание взаимосвязи между активностью генов и типом ткани может пролить свет на выполняемые им функции. Например, ген, активный в листьях, но не корнях и плодах растений, скорее всего, каким-то образом вовлечен в процесс фотосинтеза.

Различные внешние условия также влияют на функции генов. Исследователи подвергают растения стрессовым воздействиям, таким как холод и засуха, после чего используют микрочипы для идентификации генов, отвечающих синтезом определенных белков на изменение условий внешней среды. Еще одним направлением исследований является сравнение активности генов микроорганизмов одного вида, обитающих в чистой среде и в условиях загрязнения различными соединениями. Целью таких экспериментов является поиск генов, участвующих в процессах разложения загрязнителей окружающей среды.

Антисмысловые молекулы и РНК-интерференция

Еще одним способом изучения взаимосвязи между генами, белками и признаками организма является блокирование экспрессии генов и оценка происходящих при этом биохимических и видимых изменений. Для избирательного блокирования определенных генов применяются антисмысловые молекулы – короткие отрезки ДНК или РНК, комплементарно прикрепляющиеся к определенному участку ДНК и таким образом предотвращающие синтез белка, закодированного в блокируемом участке.

Похожим, но принципиально отличающимся методом является РНК-интерференция. Антисмысловая методика осуществляется с помощью одноцепочечных молекул ДНК или РНК для физического блокирования матрицы, содержащей информацию об определенном белке. При проведении РНК-интерференции в клетку вводятся небольшие двухцепочечные фрагменты РНК. Это запускает ферментативный процесс, приводящий к разрушению матриц. РНК-интерференция была случайно обнаружена в 90-х при изучении растительных клеток. Она является естественным механизмом, защищающим геном клетки от внедрения вирусов.

Точное блокирование функций определенных генов можно использовать для детального изучения клеточных процессов. Большинство биохимических процессов, протекающих в клетке, можно разделить на небольшие этапы. Иногда они напоминают цепные реакции и состоят из сложных каскадов событий, в ходе которых один белок вызывает изменения другого. Другим вариантом клеточного процесса является последовательный катализ ферментами реакций, поэтапно превращающих одно вещество в другое. В этом случае белок-фермент слегка изменяет молекулу и передает ее для дальнейшей обработки другому ферменту. Результатом большого количества мелких этапов работы многих белков является проявление того или иного признака организма. Нарушение даже одного из этапов какого-либо биохимического процесса может стать причиной заболевания. Например, если из-за точечной мутации в гене – замены или выпадения единственного нуклеотида – соответствующий белок синтезируется с ошибкой в единственной аминокислоте, он может оказаться полностью неработоспособным, что разрушит цепь биохимических реакций, в которой участвует этот фермент.

Нокаут генов

Одним из наиболее важных приемов изучения функций генов и белков является нокаут генов – целенаправленная мутация, делающая ген неработоспособным или полностью удаляющая определенный ген из хромосомы. С помощью удаления или повреждения специфического гена мы получаем очень ценную информацию о его роли в экспрессии определенного белка. Нокаутирование генов в комбинации с созданием генетически идентичных животных из культивированных клеток позволяет определить, какие изменения происходят в организме в результате отсутствия изучаемого белка. Исследователи создали большое количество линий мышей с нокаутированными генами и активно используют их для изучения процессов регуляции экспрессии генов, репарации (восстановления после повреждения) ДНК и развития опухолей.

В течение многих лет исследователи используют экспериментальные животные модели для изучения патофизиологии (механизмов возникновения и развития заболеваний) человека. В последнее время наши возможности в этой области значительно возросли за счет выявления генетических причин различных болезней, разработки методов нокаутирования определенных генов и поддержания культур эмбриональных стволовых клеток. Использование этого набора методик позволило ученым создать экспериментальные животные модели болезни Альцгеймера, процесса старения, рака, диабета, ожирения, сердечно-сосудистых аутоиммунных и многих других заболеваний. Такие приемы, как перенос ядер и культивирование эмбриональных стволовых клеток, позволят создать модели еще бОльшего количества заболеваний.

Евгения Рябцева
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/ по материалам BIO.org.
Продолжение следует.