Агроэкологические риски трансгенных энтомоцидных растений

Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений

В. В. Вельков, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, 142290, г. Пущино, Московская область (velkov@ibpm.pushchino.ru).

М. С. Соколов, Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов МЗ РФ, 142283, г. Серпухов, Московская область (toxic@online.stack.net).

А. Б. Медвинский, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская область (medvinsky@iteb.ru).

Ключевые слова: трансгенные растения, Bt-токсины, методы оценки риска, математическое моделирование.

В статье продемонстрирована необходимость разработки комплексной системы оценки экологических рисков и прогнозирования потенциальных опасностей, связанных с производством и внедрением в экосистему ГМО, и описаны основные компоненты такой экспертизы на примере энтомоцидных трансгенных растений.

Enthomocide GM plants production: agroecological risk assessment

Velkov V. V., RAS Institute for Biochemistry and Physiology of Microorganisms, 142290, Puschino-on-Oka, Moscow Region, Russia (velkov@ibpm.pushchino.ru). 

Sokolov M. S. Research Center for Toxicology and Sanitary Regulation of Biochemicals, 142283, Serpukhov, Moscow Region, Russia (toxic@online.stack.net).

Medvinsky A. B., RAS Institute for Theoretical and Experimental Biophysics, 142290, Puschino-on-Oka, Moscow Region, Russia (medvinsky@iteb.ru).

Key words: transgenic plants, Bt-toxins, risk assessment methods, mathematical modeling.

The article shows that the integrated system should be developed for environmental risk assessment and prediction of possible negative impact of GMO introduction into ecosystem. Main components of such expert system are described using enthomocide transgenic plants as an example.

--------------------------------------

Трансгенная биотехнология – одна из самых передовых и стремительно развивающихся отраслей современной биоиндустрии и, в особенности, современного сельского хозяйства. Широкомасштабное применение трансгенных культур не только обещает, согласно прогнозам, резкое повышение продуктивности сельского хозяйства в ближайшем будущем. Уже сейчас посевы трансгенных растений (далее – ТР) уже занимают значительные площади в ряде стран мира и, судя по всему, процесс расширения применения ТР будет нарастать. В США их площади оценивают в 35,7 млн га, в Аргентине – 11,8 млн га, в Китае – 1,5 млн га. Общие площади под ТР в мире в 2001 г составили 52,5 млн га, а их ежегодный прирост – 19% (1). Согласно обобщенным оценкам, за последние 12 лет в США было выращено 3.5 x 1012 единиц ТР и только в 1999-2000 гг. – более двух триллионов. При этом, как утверждается, не было зарегистрировано ни одного случая возникновения серьезных медико-биологических последствий их производства и использования (2).

Тем не менее, наряду с положительными результатами, касающимися высокой эффективности ТР и высказываемым по этому поводу оптимизмом, в обществе (в основном среди экологов, политиков, активистов природоохранительных организаций и движений) нарастает озабоченность, связанная с потенциальной экологической опасностью широкого применения ТР (3-6). Если такие опасения оправданы, то применение ТР действительно следует ограничить и оно должно строго регулироваться, если же эти опасения не оправданы – они могут сильно затормозить развитие передового сельского хозяйства. Вот почему разработка методов рациональных и научно обоснованных оценок агроэкологических рисков, связанных с широким применением трансгенных культур, является весьма актуальной и практически необходимой задачей. В частности, в настоящее время в РФ обсуждается возможность принятия государственных документов, которые (с учетом научно обоснованных оценок рисков, связанных с ТР) должны разрешить или запретить производственные посевы этих культур.

Очевидно, что методы оценки риска должны быть более системными. В настоящее время они проводятся “от случая к случаю” (case by case) по разным схемам и методикам, применительно к конкретным географическим и климатическим условиям тех регионов, где планируется интродукция ТР. В частности, методы оценки экологического риска должны быть максимально унифицированными, “прозрачными” и, по возможности, учитывающими отдаленные негативные последствия возделывания ТР для нецелевой биоты (7).

Согласно общепринятой в мировой научной печати точке зрения (8), методология оценок экологического риска ТР должна базироваться на основных принципах и положениях Картахенского Протокола по биобезопасности (2000 г.) Конвенции о биологическом разнообразии (9,10). Целью этих международно согласованных принципов является, в частности “обеспечение надлежащего уровня защиты в области безопасной передачи, обработки и использования живых измененных организмов, являющихся результатом современной биотехнологии и способных оказать неблагоприятное воздействие на сохранение и устойчивое использование биологического разнообразия…” [(9), Статья 1, с. 4, курсив наш].

В целом все риски, связанные с применением ТР, могут быть отнесены или,

1) к потенциальной опасности для здоровья человека или животных пищи и/или кормов, полученных из ТР, или

2) к потенциальной экологической опасности производства ТР для биоты различных экосистем, в особенности, для биоразнообразия агроэкосистем (далее – АЭС) (1, 11).

Типы экологических рисков, связанных с производством ТР

Методы оценки потенциальных рисков трансгенных продуктов для здоровья человека и животных достаточно хорошо разработаны. Что касается потенциальной опасности продуктов ТР, потребляемых в пищу или в качестве корма для животных (корнеплоды, зерно, силос и др.), то методы оценок этой потенциальной опасности разработаны наиболее адекватно и базируются на обширной и многолетней практике токсикологической оценки биобезопасности пищевых продуктов, новых пестицидов, агрохимикатов, кормовых добавок и прочего (12, 13). Полагается вполне обоснованно доказанным, что продукты урожая ТР, предназначенные для применения в качестве пищи или корма, практически безопасны для организма и по своим пищевым (кормовым) характеристикам и показателям наличия вредных примесей полностью эквивалентны соответствующим продуктам аналогичных не трансгенных растений (14).

В то же время, проведение конкретных оценок экологических последствий и потенциальных опасностей (которые ТР могут принести АЭС) представляет существенные и принципиальные трудности. Эта проблема, на наш взгляд, недостаточно обоснована и в методологическом плане.

Градации основных типов рисков. Риск – это произведение вероятности нежелательного события на степень тяжести его последствий. На основании того, насколько точно можно спрогнозировать различные риски и как они воспринимаются общественностью, предложена следующая классификация рисков (12).

Дамокл. Тяжесть негативных последствий велика, но вероятность нежелательного события, которое к ним приведет, весьма низка. (Примеры – крупная химическая авария, взрыв на Чернобыльской атомной электростанции).

Циклоп. Тяжесть негативных последствий велика, но вероятность нежелательного события неопределенна. (Пример – появление и неконтролируемое распространение нового, чужеродного для данного ареала, биологического вида).

Пифия. Вероятность нежелательного события и тяжесть его последствий неопределенны.

Пандора. Степень тяжести последствий неопределенна, как и вероятность самого нежелательного события, но если оно произойдет, его вредные последствия широко распространятся и/или будут существовать длительное время, и/или будут необратимыми.

Кассандра. Высокая вероятность нежелательного события и большая тяжесть его последствий, особенно – отдаленных. (Известно, что Кассандре не доверяют. Пример – недооценка общественностью опасности глобального потепления.)

Медуза. Вероятность нежелательного события и тяжесть его последствий не велики, но общественный мобилизационный потенциал этого типа риска высок. (Пример – опасения вредных воздействий на организм слабых электромагнитных полей.)

Похоже, что в данный момент широкая общественность воспринимает проблемы, связанные с расширением производства ТР, согласно типам риска “Медуза” и “Кассандра”, а специалисты – согласно типам “Пифия” или “Пандора”. Возможно ли с помощью научно обоснованных методов действительно оценить реальные количественные показатели экологического риска, сопряженного с возделыванием ТР? В особенности, с возделыванием энтмоцидных ТР (далее – ЭТР), уже производимых в мире на 12 млн га, несущих гены энтомоцидных токсинов и предназначенных для поражения целевых насекомых?

С оценками агроэкологического риска ЭТР связаны серьезные трудности. Как правило, АЭС весьма сложны и состоят из большого количества взаимодействующих между собой популяций видов биоты. Эти популяции могут находиться как в конкурентных взаимоотношениях, так и в симбиотических. Популяции объединены друг с другом довольно сложными и порой разветвленными трофическими связями. Определение и описание доминантных видов и количественная характеристика их взаимодействий как друг с другом, так и со средой – задача довольно трудоемкая и длительная. Теоретически, непосредственно вызванное ТР повышение или уменьшение численности каких-либо видов животных может привести к последующему изменению численности популяций других видов, находящихся, в частности, в отношениях типа “хищник-жертва” и т.д. Для оценки причинно-следственных связей, приведших к нежелательным последствиям, необходимо вычленение существенных характеристик АЭС и приемлемая степень достаточно детального их описания. Такими существенными характеристиками могут быть:

а) биоразнообразие – применительно к основным доминирующим видам растений, животных и микроорганизмов, а также показатели их удельной плотности (численности),

б) основные трофические взаимодействия в АЭС и,

в) критерии неприемлемости изменений в АЭС.

В настоящее время рассматриваются следующие основные типы рисков, непосредственно сопряженных с ЭТР:

1) поражение нецелевых насекомых, в частности, нарушение баланса в системах хищник-жертва, влекущее нежелательное повышение или понижение численности других животных;

2) возникновение устойчивости к энтомотоксину у целевых и нецелевых насекомых, что, в свою очередь, должно привести к:

а) снижению эффективности энтомоцидного действия ЭТР и микробных препаратов Bt-токсинов,

б) снижению численности природных микроорганизмов (в частности, Bacillus thuringiensis, далее – ВТ), нуждающихся для своего развития в жизнеспособных насекомых, восприимчивых к Bt-токсинам;

3) интрогрессия трансгенов – перенос с пыльцой ЭТР их трансгенов в исходно не трансгенные сорта и/или их дикие сородичи и вызванное этим генетическое загрязнение сортов культивируемых растений и дикоросов, уменьшающее их биоразнообразие.

Краткая характеристика Bt-защищенных и других ЭТР

Bt-защищенные ТР созданы в основном для уничтожения широкого спектра насекомых-фитофагов, вредителей сельскохозяйственных растений, за счет активности генов, кодирующих синтез различных энотомопатогенных токсинов или продукцию других соединений, приводящих к энтомоцидному действию. Мы рассмотрим проблему оценок риска производства ЭТР, в основном, на примере различных линий гибридной трансгенной кукурузы, несущей гены Bt-токсинов из разных штаммов ВТ (15).

В настоящее время известны большое разнообразие Bt-токсинов и достаточно широкий спектр их инсектицидной активности. ВТ при споруляции образует параспоральные (расположенные рядом со спорой) белковые кристаллические включения. Различные разновидности и штаммы ВТ (часто даже одного серотипа) зачастую отличаются как по спектру энтомоцидного действия, так и по степени токсичности продуцируемого токсина (cм. таблицу).

Спектр инсектицидного действия различных дельта-эндотоксинов, продуцируемых некоторыми штаммами ВТ и используемыми для создания Bt-защищенных ЭТР (16).

Это связано как с большим разнообразием токсинов, синтезируемых разными штаммами, так и с продуцированием клетками одного и того же штамма параспоральных включений, содержащих несколько разных параспоральных белков (протоксинов). Различные Bt-токсины поражают личинки насекомых (отрядов Lepidoptera, Diptera, Coleoptera и др.) и их имаго (17).

Как правило, каждый отдельный штамм ВТ синтезирует от 1 до 5 разных Bt-токсинов, объединенных в одном кристалле. Обычно индивидуальный Bt-токсин поражает насекомых, принадлежащих только к одному отряду. Однако известны несколько Bt-токсинов, имеющих более широкий спектр токсического действия и поражающих насекомых двух-трех отрядов (таблица). В коллекциях по всему миру хранится около 40000 различных штаммов ВТ, список различных Bt-токсинов на начало XXI века достиг приблизительно 120 наименований, несомненно, что этот список будет расти и дальше (18,19).

В частности, Bt-токсинами ВТ ssp. kurstaki эффективно поражаются следующие вредители сельскохозяйственных растений и лесных культур:

- вредители овощных культур: капустные совка и моль, совка ни, репница, пасленовый бражник;

- вредители полевых и кормовых культур: кукурузный стеблевой мотылек, желтушки люцерновые, луговой мотылек;

- вредители плодовых культур: листовертки, бражник–ахемон;

- вредители древесно-кустарниковых пород: Hyphantria cunea (Drury) и листовертки [Choristoneura occidentalis (Freeman), Neophasia neehopia (Felder)].

Bt-токсинами ВТ ssp. israelensis поражаются: комары, грибной (шампиньонный) комарик.

Bt-токсинами ВТ ssp. san diego, tenebrionis поражаются колорадский жук, рапсовый (?) и тополевый листоеды.

Важно представлять механизм действия Bt-токсинов и их роль в жизненном цикле ВТ.

Ассоциированные со спорами Bt-токсины нарушают работу кишечника восприимчивых насекомых. При этом развитие энтомопатогенной бактерии обеспечивается за счет гемолимфы насекомого-хозяина. Энтомоцидные Bt-белки, являющиеся протоксинами, в кишечнике насекомых (в условиях щелочной среды) протеолитически расщепляются до токсинов. Последние связываются со специфическими рецепторами и образуют поры в мембранах клеток кишечника. Это приводит либо к нарушению мембран, либо к лизису клеток и разрушению эпителия кишечника. Только после этого и только внутри кишечника пораженных насекомых осуществляется дальнейшая стадия жизненного цикла бактерий – развитие клеток из спор (18,19).

Другие гены и белки, применяемые для создания ЭТР

Для создания ЭТР применяются не только гены, кодирующие различные Bt-токсины, но также гибридные Bt-гены, сконструированные из фрагментов генов разных Bt-токсинов. В частности, для получения трансгенного арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), устойчивого к фитофагам, использованы гены, кодирующие ферменты пути биосинтеза цианогенного глюкозида дуррина у двуцветного сорго (Sorghum bicolor). Этот гликозид, синетезируясь в трансгенном арабидопсисе, обеспечивал его устойчивость к светлоногой земляной блошке (Phyllotreta nemorum), являющейся вредителем многих крестоцветных растений. Тем самым авторы полагают возможным использование генов синтеза цианогенных гликозидов для защиты культурных растений от жесткокрылых вредителей (20).

Ингибитор трипсина горчицы MTI-2, экспрессируемый в трасгенных табаке, арабидопсисе и масличном рапсе, испытывали на энтомоцидную активность на трех различных чешуекрылых вредителях. Ко всем ТР наиболее чувствительными оказались личинки капустной моли, в то время, как личинки капустной совки поражались только трансгенными табаком и арабидопсисом, но не рапсом. Очевидно, у трансгенного рапса интенсивность синтеза ингибитора трипсина была недостаточной. Что касается хлопковой совки (Spodoptera littoralis, Boisduval), то на всех ТР наблюдалась лишь задержка развития этого фитофага. Полагают, что использование генов протеиназных ингибиторов может быть одним из эффективных методов создания ЭТР (21).

Весьма интересно сообщение об удачном применении для создания ЭТР инсектицидного гена паука: рис, трансформированный этим геном, оказался устойчивым к листовертке-огневке (Cnaphalocraсis medinalis). Через 7 дней после поедания листьев трансгенного риса гибель этого вредителя достигала 61%, а гибель азиатской стеблевой огневки – 75%. Не исключено, что инсектицидный ген паука окажется весьма эффективным для создания новых ЭТР. Однако вопрос о том, насколько широким может оказаться у них видовой спектр поражаемых насекомых, пока остается открытым (22).

К энтомоцидному эффекту может приводить не только внесение в геном растения определенных чужеродных генов, но и подавление (с помощью генной инженерии) некоторых своих собственных генов, в частности тех, продукты которых привлекают вредителей. У опушенных растений железистые волоски, расположенные на поверхности многих покровных тканей, секретируют экссудаты, оказывающие репеллентное влияние на насекомых–фитофагов. Оказалось, что при подавлении в трасгенных томатах (за счет антисмысловых РНК) синтеза гидроксилазы цитохрома Р-450 происходит снижение (на 41%) синтеза основного компонента экссудата (cembratriene-diol, СBT-diol), и повышение в 19 раз синтеза его предшественника (cembratriene-ol, CBT-ol). В итоге, экссудаты таких трансгенных томатов активно поражали тлю и тем самым существенно уменьшали ее способность заселять эти растения (23).

Таким образом, возможный спектр вредных насекомых, которые могут поражаться ЭТР, весьма велик, а при генно-инженерном конструировании гибридных Bt-токсинов, состоящих из доменов разных индивидуальных токсинов, этот спектр может быть еще большим. Можно ожидать, что повышение спектра защищенности ЭТР будет сопровождаться расширением спектра поражаемых ими нецелевых насекомых и других животных. Поэтому выбор между двумя стратегиями конструирования ЭТР, предусматривающими конкретный спектр энтомоцидности, должен всесторонне оцениваться с позиции “риск : польза”.

В целом можно ожидать, что спектр различных генов, применяемых для создания ЭТР и, соответственно, спектр механизмов их действия, будут существенно расширяться. Очевидно, что расширится и спектр целевых насекомых, поражаемых этими генами. Однако пока не очевидно, к каким негативным экологическим последствиям это может привести.

Преимущества ЭТР

Полагают, что Bt-защищенные ЭТР высокопродуктивны и экологически безопасны. Bt-защищенные кукуруза, хлопчатник и картофель были интродуцированы в США в 1995-1996 гг. и уже в 1997 г выращивались на 4 млн га, в 1998 г – на 8 млн га и 12 млн га в 1999 г. Считается, что именно такой быстрый рост площадей под трансгенными Bt-культурами демонстрирует их высокую эффективность и безопасность. При этом эффективно поражаются такие основные вредители, как кукурузный стеблевой мотылек, юго-западная кукурузная огневка, табачная совка (Heliothis virescens), хлопковая совка (Helicoverpa zea Boddie), хлопковая моль и колорадский жук. Благодаря этому существенно снижаются масштабы и кратность применения химических инсектицидов (24).

Согласно многочисленным данным, Bt-защищенные ЭТР действительно весьма эффективно поражают многие целевые виды вредных насекомых. В частности, разные линии Bt-кукурузы эффективно поражали гусениц стеблевого мотылька (Ostrinia nubilalis, Hubner) и юго-западной кукурузной огневки (Diatraea grandiosella Dyar,) (25-27). В полевых экспериментах было показано, что разные линии Bt-кукурузы, синтезирующей Cry1Ab-токсин практически во всех тканях, с 99-100%-ной эффективноcтью поражают личинок стеблевого мотылька и хлопковой совки (28, 29).

При исследовании реакции на Cry1Ab-токсин Bt-кукурузы двенадцати различных полевых популяций хлопоковой совки обнаружено, что они поражаются в неодинаковой степени. Это отражает естественную популяционную вариабельность насекомых по признаку чувствительности к Bt-токсину. Полагают, что хлопковая совка чувствительна к этому токсину в большинстве природно- географических зон своего ареала (30).

Показано также эффективное поражающее действие Bt-хлопчатника (Сry1Ac) на хлопковую совку (Helicoverpa armigera, Hubner) (31). Аналогично (32) трансгенный рис c сry1Ab-геном Bt-токсина, был устойчив в течение всего периода вегетации к двум видам огневок (азиатской стеблевой и Scirpophaga incertulas).

Необходимо подчеркнуть, что экспрессия Bt-токсинов защищает не только ЭТР в период вегетации, но и их урожай. Токсинные белки, синтезируемые ЭТР, присутствуют и в зерновках, где, как оказалось, они могут также оказывать свое защитное инсктицидное действие. Основные вредители, поражающие зерно кукурузы и распространенные по всему миру, это южная амбарная огневка (Plodia interpunctella, Hubner) и зерновая моль (Sitotroga cerealella, Olivier). В опытах, проведенных в климатической камере, обнаружено, что Bt-кукуруза (CrylAb) сильно тормозит развитие и уменьшает плодовитость амбарной огневки и замедляет развитие зерновой моли, снижая численность популяций этих вредителей. Это повышает эффективность безопасного хранения урожая трансгенной кукурузы и исключает применение при этом каких-либо инсектицидов (33). Зерно двух линий Bt-кукурузы (Cry1Ab и Cry9C) в течение 5-6 месяцев после сбора урожая существенно снизило численность амбарной огневки (34).

Однако Bt-токсин защищает зерно не только от вредных насекомых, но, косвенно, и от патогенных грибов. Так, продуцируемые некоторыми фузариями фумонизины весьма опасны для человека и многих животных. Фумонизины, продуцируемые Fusarium verticillioides, F. moniliforme и другими видами, обладают канцерогенным действием. В то же время, у ряда гибридов Bt-кукурузы зерно характеризуется низким уровнем фумонизинов. Полагают, что причина этого – слабое поражение початка растений насекомыми, способствующими инфицированию его тканей токсиногенными микромицетами (35). Установлено, в частности, что в грибной биомассе, образуемой в зерне Bt-кукурузы, уровень эргостерола в 4-18 раз ниже, чем в аналогичной из не трансгенных сортов. Уровень фумонизина В в трансгенных семенах варьировал от 0,05 до 0,3 мг/кг, а в нетрансгенных – от 0,4 до 9,0 мг/кг. В итоге был сделан вывод, что защита Bt-кукурузы от стеблевого мотылька и кукурузной совки снижает инфицирование кукурузы фузариями и, соотвественно, минимизирует загрязнение ее зерна фумонизинами (36).

В общем, как показывают достаточно многочисленные данные, трансгенные Bt-культуры действительно хорошо защищены как от вредных насекомых, так и от поражения некоторыми грибными болезнями и загрязнения микотоксинами.

Экономический эффект от производства ЭТР

Если не принимать мер борьбы со стеблевым мотыльком и кукурузной совкой (Sesamia spp.), поражающими посевы кукурузы, то в США это приведет к потерям в 1 млрд долларов ежегодно. Bt-защищенные культуры, как уже отмечалось, были интродуцированы в США в 1995-1996 гг. Общий экономический эффект только от производства Bt-защищенного хлопчатника в 1998 г. оценивался в 92 млн долларов (24, 28).

Подсчитано, в частности, что применение Bt-защищенных культур может повысить чистый доход на 35% по сравнению с производством нетрансгенных растений. Это даст прибыль примерно в 668 млн долларов в год и приведет к снижению применения химических пестицидов почти на 50 млн т в год, что, в свою очередь, позволит сэкономить средства, затрачиваемых на охрану окружающей среды, в размере 632 млн долл в год. Более того, это снизит количество заболеваний, прямо или косвенно вызванных химическими инсектицидами и даст экономию средств, затрачиваемых на охрану здоровья населения в размере 37 млн долларов в год. В целом, согласно этим оптимистическим прогнозам, в США экономический эффект от производства Bt-защищенных культур может составить около 1,34 млрд долларов в год (37).

Тем не менее, существует серьезная озабоченность, что ЭТР, помимо несомненного полезного эффекта, могут оказывать негативное сопутствующее воздействие на АЭС и природные экосистемы.

Риск поражения нецелевых насекомых

Очевидно, что при действии ЭТР на нецелевые организмы может происходить:

- нарушение системы трофических связей в цепях питания (растения-насекомые или другие беспозвоночные);

- нарушение функционирования первичных звеньев экосистемы хищник-жертва (насекомое-насекомое, фитофаг-энтомофаг);

- нарушение численности и видового состава прикорневых микробных популяций;

- уменьшение численности природных популяций ВТ, нуждающихся для своего развития в жизнеспособных личинках насекомых, чувствительных к действию токсина.

Анализ опубликованных данных позволяет полагать, что при действии ЭТР на нецелевых насекомых наибольшую опасность могут представлять:

- уменьшение численности насекомых (или других организмов-хозяев), которые являются пищей для хищных организмов;

- уменьшение численности насекомых, поражающих вредных членистоногих, в особенности – переносчиков инфекций;

- уменьшение численности насекомых, необходимых для развития полезных микроорганизмов;

- уменьшение численности насекомых–опылителей.

В основном, рассматриваются пока только два основных механизма, за счет которых ЭТР могут понизить и без того ущербное биоразнообразие АЭС. Это, во-первых, поражение нецелевых насекомых и других почвообитающих беспозвоночных и, во-вторых, уменьшение биоразнообразия родственных дикорастущих форм нетрансгенных растений за счет их переопыления с ЭТР, поскольку их пыльца несет гены энтомоцидных белков.

В целом в опытах по оценке риска негативного воздействия ЭТР на нецелевые организмы необходимо руководствоваться следующими основными подходами:

- определение в онтогенезе концентрации токсина в различных органах и тканях ЭТР (при этом весьма существенна информация о динамике содержания токсина в течение вегетационного сезона, а также о его динамике в фитомассе ЭТР, оставшейся в АЭС после сбора урожая),

- в лабораторных условиях с рационально выбранными нецелевыми тест-объектами и на диетах, содержащих токсин, определяются показатели его токсичности (ЛД 50, ЛД 90 и др.),

- в лабораторных условиях на диетах, содержащих ткани, органы или части ЭТР, определяется уровень вредности сенсибилизированного энтомотоксина для нецелевых насекомых,

- в изолированных условиях (теплицы, климатические камеры) в процессе культивирования ЭТР проводится определение их токсичности в отношении нецелевых тест-объектов;

- в открытых АЭС (в полевых экспериментах) в условиях большого разнообразия взаимодействующих популяций проводится определение изменения структуры и численности целевых и нецелевых видов под действием ЭТР.

Следует особо подчеркнуть, что для объективной оценки риска поражения нецелевых организмов целесообразно комплексное использование всех указанных подходов в одном широкомасштабном исследовании. Это связано с тем, что результаты, полученные в лабораторных условиях, в ряде случаев весьма затруднительно экстраполировать на обстановку реальных АЭС.

Попытаемся кратко рассмотреть отдельные примеры оценки риска поражения ЭТР нецелевых организмов. Несмотря на то, что проявление у ЭТР общей токсичности и тем более, мутагенности, теоретически мало вероятно, тем не менее подобные опыты необходимы, чтобы безопасность ЭТР не вызывала сомнений как у специалистов, так и у широкой общественности (38).

Оценка общей токсичности ЭТР

В тесте на гидробионты использовались дафнии (Daphnia magna) для оценки возможной токсичности пыльцы Bt-кукурузы (Сry1Ab), которая может попасть в водоемы, расположенные поблизости от посевов ЭТР. Как оказалось, выживаемость дафний в опытном и контрольном вариантах была одинаково стопроцентной, никаких признаков токсичности у трансгенной пыльцы обнаружено не было. Биотест с использованием дождевых червей (Eisenia foetida) и белковых препаратов из листьев Bt-кукурузы (Cry1Ab) также дал отрицательный результат (39).

Оценка потенциальной мутагенности ЭТР

Такие тесты могут проводиться с применением стандартных методов, оценивающих изменение частоты возникновения мутаций (реверсий) у тестерных штаммов Salmonella thyphimurium (40), так и возникновение морфологических мутаций у тестерных линий плодовых мушек Drosophila melanogaster (41).

Риск поражения нецелевых насекомых – ключевых звеньев трофических цепей

Специальное и достаточно детальное исследование было посвящено изучению потенциального влияния Bt-кукурузы (CryIAb) на полезных кокцинеллид (Coccinellidae, Homoptera) – хищников и паразитов двукрылых, перепончатокрылых и жесткокрылых вредителей. Эти фитофаги – важный источник пищи для полезных хищных насекомых. Работы проводились в полевых условиях на трансгенных и контрольных растениях, а также с применением в качестве эталона сравнения инсектицида перметрина. В итоге не было обнаружено:

1) разницы в общей численности всех насекомых, обитавших на трансгенных и контрольных растениях,

2) разницы в численности насекомых указанного отряда и

3) изменений таксономического состава популяций, обитающих на трансгенной кукурузе.

В то же время, обработка перметрином значительно снижала численности всех указанных насекомых, в особенности кокцинеллид, таких как божьи коровки (Coleomegilla maculata), являющихся очень важными хищниками вредных насекомых агроценоза (39,42). В специальном лабораторном эксперименте было подтверждено, что развитие личинок божьих коровок, когда они питались исключительно пыльцой Bt-кукурузы (Cry1Ab), не отличалось от контроля (43).

В лабораторных условиях исследовалась динамика численности черемуховой тли (Rhodopalosiphum padi) и питающихся тлей златоглазок (Chrysoperla carnea), обитающих на контрольной и Bt-кукурузе (Cry1Ab). Негативного влияния Bt-кукурузы на соотношение и динамику численности консорбентов в этой системе “хищник-жертва” установлено не было (44).

Оценка риска поражения энтомофагов – естественных хищников целевых насекомых

Одно из потенциальных негативных последствий энтомоцидной активности ТР – это возможное поражение ими насекомых-энтомофагов. Одним из самых серьезных природных врагов кукурузного стеблевого мотылька является златоглазка обыкновенная. Лабораторные опыты показали, что пораженные Bt-кукурузой (СryIAb) личинки стеблевого мотылька (как полагают, содержащие в кишечнике активный Bt-токсин) действительно являются плохой пищей для златоглазок: скорость ее смертности на Bt-кукурузе составила 67%, а в контроле – 37% (45). В дальнейших лабораторных опытах использовали очищенный и активизированный обработкой трипсином препарат Cry1Ab-токсина, в присутствии которого выращивали личинки златоглазки. Подтверждено, что белок CrylAb в условиях искусственной диеты действительно токсичен для личинок энтомофага в концентрации 100 мкг/мл (46).

Однако можно ли считать результаты таких лабораторных оценок адекватными полевым условиям? Как известно, в природных условиях златоглазка питается не только личинками стеблевого мотылька, но, преимущественно, тлей

Что касается других энтомофагов, уничтожающих кукурузного мотылька, то в полевых экспериментах было показано (47), что Bt-кукуруза не оказывает негативного влияния на таких естественных его врагов, как бракониды (Eriborus terebrans, Macrocentus grandii).

Риск поражения наиболее распространенных энтомофагов

Если ЭТР будут массово поражать хищных насекомых, то это приведет к массовому размножению их жертв, что весьма нежелательно. Личинки златоглазки, именуемые “львами тли”, а также сходные с ней виды энтомофагов, питаются многими насекомыми, их яйцами, а также клещами. Двухлетние полевые испытания и лабораторные опыты по кормлению личинок пыльцой Bt-кукурузы показали отсутствие негативного эффекта Bt-пыльцы на развитие златоглазки. Лабораторные исследования подтвердили отсутствие негативного влияния Bt-кукурузы на преимагинальное развитие и размножение также таких хищных насекомых, как ориус (Orius insidiosus, Say) и божья коровка (43).

Риск поражения нецелевых насекомых-фитофагов

В специальном исследовании было показано, что тля, питающаяся на Bt-кукурузе (Cry1Ab), не содержит в своем организме этого токсина, однако Bt-токсин обнаруживали в личинках хлопковой совки (Spodoptera littoralis, Boisduval) и в ее экскрементах. Это свидетельствует о том, что Bt-токсин расщеплялся в кишечнике совки. Что касается тли, то считают, что этот доминантный фитофаг, являющийся пищей полезных насекомых, Bt-кукурузой не поражается (48).

В полевых экспериментах исследовалось влияние Bt-кукрузы (Cry1Ab) на фауну летающих и обитающих на листьях и в почве нецелевых членистоногих - представителей семейств Lycosidae, Linyphiidae, Opiliones, Staphylinidae, Carabidae, Cicadellidae, Anthocoridae, Nabidae, Coccinellidae, Chrysopidae и Chalcoidea. Подтверждено, что хотя Bt-кукуруза (Cry1Ab) действительно надежно защищена от стеблевого мотылька, она не оказывала негативного влияния на всех изученных членистоногих. В процессе полевых испытаний не обнаружено влияния Bt-кукурузы (Cry1Ab) на развитие личинок: чешуекрылых вредителей семейства Noctuidae, совки ипсилон (Agrotis ipsilon, Hufnagel), Papaipema nebris (Geuneаe), Pseudaletia unipuncta (Haworth) и хлопоковой совки (Helicoverpa zea, Boddie) (49).

Наиболее детальное изучение влияния ЭТР на нецелевую биоту проводилось на различных гибридах Bt-защищенной кукурузы, в частности, на линиях синтезирующих (за счет укороченных генов) активные формы токсинов Cry1Ab и Cry1Aс, первичной мишенью которых были кукурузный стеблевой мотылек и совка (Sesamia spp.). Некоторые линии таких ЭТР обеспечивали защиту кукурузы также и от других чешуекрылых, повреждающих кукурузу, в частности, от юго-западной кукурузной огневки, от хлопковой и луговой совок. Результаты сравнительных исследований ЭТР и контрольных растений не выявили между ними разницы ни в общей численности насекомых, ни в количестве таких насекомых, как божья коровка, тли и пчелы. Не обнаружено никакого вредного действия Bt-кукурузы и на насекомых отрядов Diptera (Lycosidae, Linyphiidae, Opiliones, Staphylinidae, Carabidae, Cicadellidae) и Thysanoptera (Anthocoridae, Nabidae, Coccinellidae, Chrysopidae, Chalcoidea) (39, 42).

Риск поражения почвообитающих насекомых

По итогам лабораторных испытаний влияния белковых препаратов из листьев Bt-кукурузы (Cry1Ab) на развитие коллемболлы (Folsomia candida) было найдено, что значение их максимальной недействующей концентрации составляло 125 мкг/кг, значение максимально переносимой концентрации – от 125 мг белка/кг почвы (0,088 мкг/кг Cry1Ab) до 250 мкг белка/кг почвы (0,175 мкг/кг Cry1Ab). Тем не менее, был сделан вывод, что наличие Bt-токсина в почве не будет оказывать негативного действия на коллемболу, так как это насекомое питается, в основном, разложившимся растительным материалом, колонизированным грибами, а не нативными растениями. Полагают, что разложившиеся остатки ТР не будут содержать опасные для этого насекомого концентрации Bt-токсина (39).

Риск поражения пчел

Негативное влияние пыльцы ЭТР на пчел могло бы иметь весьма неблагоприятные как экономические, так и экологические последствия. Именно поэтому проведена серьезная оценка подобной ситуации. В лабораторных условиях личинок медоносных пчел (Apis mellifera L.) выращивали на пыльце с Cry1A-токсином и на пыльце контрольной кукурузы. Даже при такой высокой нагрузке Bt-токсина какого либо токсического эффекта на пчел обнаружено не было (39, 42). Аналогичные результаты были получены и в случае Cry3B- токсина (50). В то же время, Bt-защищенный масличный рапс снижал способность пчел к обучению (51).

Оценки риска поражения нецелевых чешуекрылых

Бабочка данаида Монарх (Danaus plexippus) – одна из самых распространенных в Северо-Американском регионе (от центральной Мексики до Южной Канады). Ее жизнь полностью зависит от листьев молочая, которыми питаются ее личинки. Наблюдающееся в последнее время падение численности популяций данаиды – предмет большой озабоченности ученых. В лабораторных условиях использовали листья молочая, искусcтвенно покрытые пыльцой Bt-кукурузы. Обнаружилось, что при такой диете смертность личинок данаиды превышала контроль (52).

Открытым оставался вопрос, какое количество пыльцы Bt-кукурузы может быть на листьях сорного молочая, растущего по соседству с трансгенной кукурузой. С этой целью для кормления личинок данаиды использовали листья молочая, собранные с растений, растущих в поле рядом с Bt-кукурузой (Cry1Ab). Оказалось, что при питании листьями молочая в полевых условиях смертность личинок данаиды составила 19%, а в контроле все личинки выжили. Был сделан вывод, что в полевых условиях при любой плотности пыльцы Bt-кукурузы, естественно попадающей на поверхность молочая, она не оказывает летального действия на личинки данаиды. В целом, двухлетние исследования показали, что влияние пыльцы Bt-кукурузы на популяции этой бабочки незначительно и им можно пренебречь (53).

В недавних полевых исследованиях также не обнаружили летального действия пыльцы Bt-кукурузы на парусника поликсена (Papilio polyxenes) и данаиду. Хотя пятикратные дожди смыли большую часть пыльцы с ЭТР, было установлено значительное снижение скорости роста личинок парусника, причиной которого считается трансгенная пыльца. Авторы полагают, что в полевых условиях Bt-пыльца оказывает сублетальное действие на его личинки (54).

Более однозначный ответ на рассматриваемый вопрос могли бы дать полевые эксперименты по оценке токсичности для личинок данаиды кристаллических белковых препаратов разных Bt-токсинов из препаратов пыльцы, собранных с различных гибридов Bt-кукурузы. Действительно, было выполнено достаточно детальное тестирование сравнительной токсичности как препаратов Bt-токсинов (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry9C, Cry1F), так и пыльцы из соответствующих гибридов Bt-кукурузы. Токсины включали в состав искусственной диеты, а пыльцу, собранную с ТР, наносили на диски из листьев молочая. Как оказалось, препараты очищенных кристаллов Bt-токсинов (Cry9C, Cry1F) относительно не токсичны для личинок первого возраста данаиды, но к токсинам Cry1Ab и Cry1Ac эти личинки были высокочувствительны. Взрослые личинки старших возрастов были в 12-23 раза менее чувствительны к Cry1Ab-токсину в сравнении с личинками первого возраста. Опыты показали, что контаминирование пищи трансгенной пыльцой может весьма по-разному и даже “драматическим” образом влиять на выживаемость личинок и на динамику их массы и, тем самым, приводить к ложным выводам. Только пыльца из Bt-кукурузы (Cry1Ab) воспроизводимо демонстрировала негативное влияние на личинки Монарха, в то время как пыльца гибридов кукурузы, продуцирующих другие токсины (Cry1Aс, Cry1F и Cry9C) в полевых условиях острого токсического действия на развитие личинок не оказывала (55). В целом, лабораторные и полевые оценки риска поражения Bt-токсином ЭТР личинок данаиды демонстрируют, что подобный риск в реальных полевых условиях исключить нельзя.

В общем, даже краткий обзор результатов лабораторных и полевых оценок риска поражения ЭТР нецелевых чешуекрылых насекомых показывает, что:

1) пыльца Bt-кукурузы действительно может оказывать негативное влияние на личинок некоторых нецелевых насекомых и

2) степень этого негативного влияния зависит от типа Bt-токсина и, тем самым, от конкретных энтомоцидных характеристик и вида ЭТР;

3) результаты оценки риска для нецелевых насекомых, полученные на одном сорте (гибриде) ЭТР не могут быть a priori автоматически распространены на другие сорта (гибриды).

В настоящее время наиболее рациональным представляется следующий комплексный подход при оценке риска поражения ЭТР нецелевых насекомых:

1. Составление описания сообщества насекомых (включая почвообитающих) для АЭС, в которую предполагается интродуцировать ЭТР по схеме:

        А. Основные доминанатные виды насекомых, определяемые согласно экспертным оценкам в течение двух-трех лет (сезонов).

      Б. Для этих доминантных видов в соответствии с требованиями современного экологического мониторинга (55) должны быть указаны статические и динамические популяционные характеристики, а также показатели структуры сообщества и его функциональные характеристики.

2. В лабораторных экспериментах должна быть установлена степень поражения представителей основных доминирующих видов и представителей ключевых звеньев в системах хищник-жертва:

      - препаратами соответствующего энтомотоксина,

      - пыльцой ЭТР,

     - диетами, содержащими препараты с ингридиентами из разных тканей, частей и органов ЭТР.

 3. В условиях климатических камер (теплиц) должна быть установлена степень поражения представителей основных доминирующих видов и ключевых звеньев в системах хищник-жертва, обитающих на контрольных и ЭТР.

 В этих же условиях должна быть проведена сравнительная оценка степени поражения тех же насекомых в местах планируемой интродукции ЭТР наиболее распространенными химическими инсектицидами.

 4. В полевых условиях должна быть установлена степень поражения представителей основных доминирующих видов и ключевых звеньев в системах хищник-жертва, обитающих на контрольных и ЭТР.

 В этих же условиях должна быть сравнительно оценена степень поражения ЭТР тех же тест-насекомых наиболее распространенными инсектицидами (56).

 

 В целом, в настоящее время представляется весьма целесообразным, чтобы результаты комплексной оценки потенциального риска ЭТР содержали информацию о динамике целевых и нецелевых насекомых:

      - в АЭС с традиционными, нетрансгенными растениями без применения инсектцидов,

      - в АЭС с традиционными, нетрансгенными растениями с применением инсектцидов,

      - в АЭС с ЭТР в отсутствие химических инсектцидов.

Именно такой многоэтапный, комплексный и сравнительный анализ в наибольшей степени позволит обосновать экологически приемлемое решение о целесообразности производства ЭТР.

Следует особо отметить, что методы оценки риска поражения ЭТР нецелевых насекомых, применяемые в настоящее время в разных странах, пока еще находятся в стадии разработки (58, 59). Совершенно очевидно, что международная гармонизация таких оценок весьма необходима.

Риск негативного воздействия на ризосферные микроорганизмы

Трансгенное растение может секретировать трансгенные белки или низкомолекулярные соединения (синтез которых обусловлен трансгенами) в прикорневое пространство и таким образом воздействовать на ризосферные микробные популяции. Последние, как известно, играют весьма важную роль в жизнедеятельности растений и в их сопротивляемости фитопатогенам. Именно в ризосфере, весьма богатой питательными веществами, выделяемыми растением, и содержащей многочисленные контактирующие микробные популяции, происходит интенсивный внутри- и межвидовой генетический перенос, осуществляемый конъюгативными плазмидами (60, 61).

Действительно, трансгенный табак, продуцирующий низкомолекулярные опины, синтез которых кодируется Ti-плазмидами Agrobacterium tumefaciens, весьма существенным образом влиял на конкурентные взаимоотношения двух ризосферных штаммов Pseudomonas fluorescens. Штамм, который способен катаболизировать опины, вытеснял из ризосферы штамм, к этому не способный. Был сделан вывод, что ТР может обеспечивать селективное преимущество тем микроорганизмам, которые способны утилизировать продукты, синтез которых вызван трансгенами (62). Аналогичные результаты получены и с использованием трансформированного Ti-плазмидой лядвенца рогатого (Lotus corniculatus), продуцирующего маннопин. И в этом случае утилизирующие данный опин псевдомонады имели селективное преимущество в ризосфере ТР (63).

Секретироваться в прикорневую систему могут не только низкомолекулярные соединения растений. В лабораторных и полевых экспериментах обнаружено, что в корневых экссудатах Bt-кукурузы (Cry1Ab) содержится данный Bt-токсин. Это доказано и иммунологически, и тестированием токсического действия экссудатов на личинках чувствительных насекомых. Полагают, что выделение Bt-токсина в прикорневое пространство, с одной стороны, может повысить эффективность поражения целевых и нецелевых организмов, а с другой - повысить вероятность селекции целевых насекомых, устойчивых к энтомотоксину. Очевидно, что связывание токсина органо-минеральными коллоидами и илистыми частицами почвы защищает его от бидеградации (64, 65).

Маловероятно ожидать, что Bt-токсин может оказаться активным в отношении почвенной микробобиоты. Тем не менее, такая возможность проверялась. Показано (в опытых с чистыми и смешанными культурами), что Bt-токсины из ВТ ssp. kurstaki (штаммы morrisoni tenebrionis и israelensis) не токсичны для восьми грамотрицательных, пяти грамположительных и одной цианобактерии, а также для некоторых грибов, в частности, для двух видов Zygomyces, одного вида Ascomyces, двух видов Deuteromyces, для двух видов дрожжей, для зеленых и диатомовых водорослей (66).

Несмотря на это, присутствие активных Bt-токсинов в почве на больших территориях, длительно засеваемых Bt-защищенными растениями, может, как отмечалось, оказать серьезное негативное влияние на некоторых насекомых и беспозвоночных. Поэтому представляется весьма целесообразным (67) регулярный мониторинг содержания в почве и в остатках фитомассы токсинов, синтезируемых ЭТР (с коррекцией на то, что в почве могут находиться споры природных штаммов ВТ, содержащие различные Bt-токсины).

Трансгенный картофель, синтезирующий лизоцим бактериофага Т4, тщательно проверяли в двух независимых лабораторных и полевых исследованиях на способность поражать различные ризосферные микроорганизмы. Разницы в составе и численности популяций у ризосферы трансгенных и контрольных растений выявлено не было (68, 69).

Таким образом, имеющиеся в нашем распоряжении, но, к сожалению, весьма немногочисленные данные свидетельствуют, что прикорневые экссудаты ТР действительно могут содержать как низкомолекулярные, так и белковые продукты, синтез которых кодируется трансгенами. Низкомолекулярные соединения (опины, в частности) стимулируют рост тех ризосферных популяций, которые способны их утилизировать. Данных о том, что белки, кодируемые трансгенами, непосредственно негативно влияют на ризосферые микроорганизмы, пока нет. Очевидно, такие белки, иммобилизованные почвой, становятся в значительной мере недоступными для микробной деградации. Нет данных и том, как и с какой частотой происходит в ризосфере ТР конъюгативный генетический перенос.

В целом, для оценки риска негативного влияния ТР на ризосферные популяции представляется целесообразным исследование в лабораторных и полевых условиях:

-видового состава и численности основных микробных видов, доминирующих в ризосфере трансгенных и контрольных растений,

-интенсивности генетического переноса между модельными донорными и реципиентными штаммами, интродуцированными в ризосферу трансгенных и контрольных растений (70, 71).

Существует еще один риск, внимание которому практически не уделяется. Присутствие в АЭС значительных количеств Bt-токсинов, синтезируемых ЭТР, и массовая гибель чувствительных к нему насекомых может привести к существенному снижению численности природных популяций ВТ, нуждающихся для своего развития в личинках членистоногих, чувствительных к нативным Bt-токсинам. Как отмечалось, эволюция ВТ идет по пути расширения спектра действия их Bt-токсинов, что позволяет этим бактериям паразитировать на большем количестве видов насекомых (18).

Совершенно непредсказуемо, какого следующего хозяина в качестве трофического субстрата для своего токсического действия выберет эволюция популяций ВТ, утративших возможность развиваться в традиционных для них видах. Пока известно, что природные Bt-токсины могут поражать не только представителей пяти отрядов насекомых, но также клещей, нематод, трематод, моллюсков и простейших животных (17).

Похоже, что риск эволюции ВТ к расширению спектра трофических мишеней, стимулируемой Bt-защищенными растениями, относится к самому нежелательному типу – Циклоп (тяжесть негативных последствий велика, но вероятность нежелательного события неопределенна). Вот почему представляется весьма целесообразным регулярный мониторинг численности природных популяции ВТ там, где ведется широкомасштабное выращивание Bt-защищенных ЭТР.

Однако ЭТР могут стимулировать эволюцию не только бактерий ВТ, но и других видов биоты.

Оценка риска возникновения и распространения насекомых, устойчивых к Bt-токсину

Длительная экспозиция больших популяций насекомых, исходно чувствительных к действию Bt-продуцирующих растений, может привести к селекции насекомых-мутантов, устойчивых к энтомотоксину и затем к быстрому (в отсутствие конкуренции) их размножению. В результате чувствительные к Bt-токсину популяции могут быть вытеснены популяциями устойчивых фитофагов, что сделает экономически неоправданным как возделывание ЭТР, так и использование микробных препаратов Bt-токсина для борьбы с вредными насекомыми. С другой стороны, массовое размножение насекомых, устойчивых к Bt-токсину, может привести к резкому падению численности ВТ и параллельно к селективному давлению на распространение мутантных форм ВТ с измененной специфичностью Bt-токсина, способных поражать Bt-устойчивые мутанты насекомых. Для оценки риска возникновения организмов, устойчивых к Bt-токсину, весьма существенна следующая информация:

а) доказательства, что такие мутанты действительно возникают;

в) в каких именно генах и какие именно мутации приводят к устойчивости и каков ее механизм;

г) характер доминирования алеллей устойчивости и чувствительности у потомства скрещивания устойчивых и чувствительных форм,

д) частота встречаемости аллелей устойчивости к токсину в природных популяциях фитофагов;

е) жизнеспособность устойчивых мутантов насекомых в сравнении с чувствительными их формами;

ж) стратегия сдерживания распространения устойчивых форм фитофагов.

Мутанты, устойчивые к Bt-токсину

Устойчивым к Bt-токсину может стать основной вредитель кукурузы – стеблевой мотылек. Как показано в двух параллельных, но независимых лабораторных опытах, проводившихся по разным протоколам (в США и во Франции), мутантные высокоустойчивые к Cry1Ab-токсину насекомые обнаруживаются уже на седьмой генерации (устойчивость повышена в 14 раз), на девятой генерации (в 13 раз) и на 32 генерации (устойчивость повышена в 32 раза). При этом изначально полагалось, что низкий уровень устойчивости к Bt-токсину весьма часто встречается в природных популяциях этого опасного вредителя (72).

В лабораторных условиях были получены мутанты и другого весьма опасного вредителя – табачной огневки (Heliothis virescens), устойчивые к Cry1Ac-токсину и, что крайне важно, эти мутанты оказались также устойчивыми к и другим Bt-токсинам (73).

Одновременная устойчивость к разным Bt-токсинам была обнаружена у мутантов двух штаммов капустной моли (Plutella xylostella L.) с использованием трансгенных растений броколли, синтезирующих Cry1C-токсин. Полученные мутанты были в 1090 раз более устойчивы к Cry1C токсину и, что особенно настораживает, демонстрировали уровень перекрестной устойчивости (в 390 раз!) к таким токсинам, как Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry1J (74).

Культивирование в лабораторных условиях хлопоковой моли (Pectinophora gossypiella) на диетах, содержащих Cry1Ac-токсин, привело к отбору ее мутантов, у которых устойчивость к токсину была повышена более чем в 100 раз. Скрещиваниями исходных и мутантных насекомых было установлено, что устойчивость к малым концентрациям токсина доминантна, к промежуточным – частично рецессивна и полностью рецессивна к высоким концентрациям токсина (75).

Похоже, что может быть несколько генов, мутации которых ведут к устойчивости фитофага к Bt-токсину. Так, у капустной моли, как оказалось, есть два разных гена, мутации которых могут приводить к устойчивости к Cry1Ab-токсину. В одном случае устойчивость была доминантной, в другом – рецессивной (76).

Означает ли вышесказанное, что мутации устойчивости к Bt-токсину могут возникнуть у любого организма, исходно чувствительного к нему? Похоже, что да. Выделены 10 рецессивных мутантов паразитической нематоды Caenorhabditis elegans, устойчивых к Bt-токсину (77).

Мутации каких именно генов могут приводить к устойчивости к Bt-токсину? По всей вероятности, это гены, кодирующих рецепторы, с которыми связывается токсин. Очень важно знать, рецессивны или доминантны такие мутации.

Гены устойчивости к Bt-токсину

У кукурузного стеблевого мотылька полученная в лабораторных условиях устойчивость к Bt-токсину (препарат Dipel ES) является аутосомальной и не полностью доминантной. Если такие же мутации будут возникать и в полевых условиях, то это может сделать не эффективными способы, препятствующие распространению устойчивых к ЭТР мутантых насекомых (78), основанные на том, что мутации устойчивости должны быть рецессивными (high-dose/refuge strategy, см.ниже).

У табачной огневки, повреждающей хлопчатник, устойчивость к Cry1Ac-токсину индуцируется мутационным нарушением гена, кодирующего образование кадгерина (79).

Ген устойчивости к Cry5B-токсину был клонирован из соотвествующего мутанта нематоды (Caenorhabditis elegans). Этот bre-5-ген кодирует бета-1,3-галактозилтрансферазу, которая принимает участие в синтезе углеводов. Инактивация bre-5-гена приводит организм к устойчивости к Cry5B-токсину. Он перестает связываться со стенками кишечниками и поглощаться его клетками. Существенно, что при этом наблюдалась перекрестная устойчивость тест-организмов и к Cry14A-токсину (80).

Частота встречаемости аллелей устойчивости к Bt-токсину в природных популяциях

Стратегия сдерживания распространения устойчивых к Bt-токсину форм вредителей базируется на теоретических моделях. Их ключевое положение состоит в том, что вероятность возникновения таких форм весьма мала. Однако результаты полевых исследований говорят о совершенно противоположном. Как уже упоминалось, мутанты кукурузного стеблевого мотылька, высокоустойчивые к Cry1Ab-токсину, широко распространены и при росте на искусственных диетах обнаруживаются довольно быстро, уже на седьмой генерации (72).

Среди особей хлопковой моли, проанализированных на полях хлопчатника в 1997 г в штате Аризоне (США), частота рецессивного аллеля устойчивости к Cry1Ac-токсину составляла 0,16. Оказалось неожиданным, что эта частота не возросла в период с 1997 по 1999 г., когда на тех же полях широко выращивался Bt-защищенный хлопчатник. Причина, почему устойчивый к Bt-токсину вредитель не получил селективного преимущества на Bt-хлопчатнике, не ясна (81). Одна из возможностей заключается в том, что мутанты имели пониженную жизнеспособность (см. ниже)

В популяции огневки (Scirpophaga incertulas, Walker) на Филиппинах высоко устойчивых мутантов хотя и не было обнаружено, но частота аллелей, частично устойчивых к токсину Cry1Ab, была 4,8 x 10-3, что, по мнению авторов, позволяет применять в отношении S. incertulas для сдерживания распространения устойчивых мутантов тактику high dose/refuge strategy (82).

В лабораторных условиях с использованием искусственных диет, содержащих Bt-токсины и Bt-защищенную брокколи, получены данные по частоте встречаемости аллелей устойчивости к токсинам Cry1Ac и Cry1C у капустной моли. Определения на искусственных диетах, дающие более достоверные результаты, показали (83), что частота алеллей, устойчивых к Cry1Ac-токсину, составила 0,012.

Частота встречаемости устойчивости к Bt-токсину у табачной огневки также весьма высока и составляет 1,5 x 10-3 (84).

Жизнеспособность мутантов устойчивых к Bt-токсину

При сравнении жизнеспособности устойчивого к Bt-токсину мутанта хлопковой моли обнаружено, что при росте на не трансгенном хлопчатнике этот мутант имел жизнеспособность, пониженную на 50% (85) Выживаемость трех Bt-устойчивых мутантов хлопковой моли после зимнего периода было понижена на 70% (86). Более детальная информация о генетических и молекулярных механизмах устойчивости к Bt-токсинам содержится в обзорах (87,88).

В целом можно заключить, что:

- мутации, приводящие к устойчивости к Bt-токсину, встречаются весьма часто,

- они могут возникать у многих (если не у всех) видов фитофагов, чувствительных к Bt-токсинам,

- они могут возникать в нескольких разных генах;

- они нарушают взаимодействие токсина со стенками кишечника;

- они могут быть, по крайней мере, частично доминантными и

- могут иметь пониженную жизнеспособность и могут

- приводить к перекрестной и множественной устойчивости к разным Bt-токсинам.

Стратегия сдерживания распространения мутантов, устойчивых к Bt-токсину (high-dose/refuge strategy), базируется на двух ключевых предположениях: 1) мутации устойчивости к токсину должны быть рецессивны, а чувствительность – доминантна: при скрещивании таких особей их потомство должно быть чувствительным к токсину, 2) частота мутаций к устойчивости должна быть достаточно малой. Эта стратегия предполагает, что по соседству с посевами ЭТР должны быть поля с не трансгенными растениями, на которых смогли бы размножаться высокочувствительные к Bt-токсину фитофаги. Последние, скрещиваясь с устойчивыми мутантами (и исходя из того, что чувствительность к Bt-токсину доминантна), давали бы чувствительное к токсину потомство и, тем самым, препятствовали бы массовому размножению форм, устойчивых к Bt-токсину (89, 90). Однако как следует из приведенных данных, оба ключевых предположения, на которых держится эта стратегия, могут не соответствовать действительной ситуации.

Для оценки риска возникновения и распространения мутантов целевых и нецелевых организмов, устойчивых к ЭТР, а также для прогнозирования применимости стратегий сдерживания распространения таких устойчивых мутантов целесообразны:

- оценка частоты встречаемости мутантов, устойчивых к токсину.

 Среди популяции целевых и нецелевых организмов должна осуществляться:

- оценка уровня доминантности или рецессивности таких мутантов,

- оценка жизнеспособности таких мутантов при их росте на трансгенных и не трансгенных растениях.