Новый метод секвенирования ДНК из одной клетки

Благодаря новому методу секвенирования ДНК из одной клетки станет возможным быстрое и простое сравнение генетического материала нескольких клеток, что облегчит диагностику рака и изучение биологических процессов в клетках.

Последовательность ДНК многих организмов – в том числе человека, крысы, курицы, пчелы – уже определена. И хотя полногеномное секвенирование организма представляет собой довольно трудную задачу, секвенировать ДНК лишь одной клетки гораздо сложнее.

Для того чтобы получить достаточное количество генетического материала для секвенирования, обычно требуется тысячи или даже миллионы клеток. В такой ситуации практически невозможно определить, в какой именно клетке какая мутация была обнаружена, поскольку ДНК всех клеток анализируется одновременно.

Ученые из Гарвардского Университета в Кембридже (Harvard University in Cambridge, США) разработали особую методику копирования ДНК, позволяющую осуществлять секвенирование более 90% генома одной клетки. Метод также облегчит детектирование минорных вариантов в последовательности ДНК одной клетки и, таким образом, позволит идентифицировать генетические различия между отдельными клетками. Такие различия помогут выяснить, как опухоли становятся злокачественными, как появляются репродуктивные клетки и чем отличаются отдельные нейроны. В статье, опубликованной в журнале Science [1], ученые описывают разработанную методику.

До настоящего времени, чтобы секвенировать геном одной клетки, ученые сначала должны были сделать множество копий ее ДНК с помощью методик, включающих ПЦР (полимеразная цепная реакция). Недостатком таких методов является то, что одни участки генома амплифицируются интенсивнее, чем другие. Это приводит к тому, что некоторые области генома клетки остаются недетектируемыми. В результате, большинство попыток секвенировать полный геном клетки заканчивались секвенированием, в лучшем случае, 70% генома (хотя гораздо чаще этот показатель составлял около 40%).

Санни Се (Sunney Xie), биохимик из Гарвардского Университета, и его коллеги разработали методику, названную MALBAC (multiple annealing and looping-based amplification cycles), которая позволяет секвенировать 93% генома одной клетки. По методике из клетки выделяется ДНК, готовится смесь для амплификации с добавлением специфических праймеров, комплементарных разным участкам генома.

Праймеры состоят из двух частей – варьирующих «липких» 8-нуклеотидных участков для связывания с ДНК и общей последовательности из 27 нуклеотидов, которая предназначена для предотвращения чрезмерной амплификации. Общий 27-нуклеотидный мотив включается в новосинтезированный ампликон, который, благодаря особой последовательности мотива, образует петлю и не может послужить матрицей для следующего цикла амплификации.

«MALBAC открывает нам новые возможности», - говорит Бинг Рэн (Bing Ren), ученый из Калифорнийского Университета в Сан-Диего (США). Метод, например, может быть использован для исследования скорости накопления мутаций, поиска вариаций числа копий генов в клетке и хромосомных аномалий в одной клеточной популяции.

«Думаю, люди готовы начать использовать метод прямо сейчас», - говорит Джеймс Эбервайин (James Eberwine) из Медицинской Школы Перельмана при Университете Пенсильвании (Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, США). Однако он добавляет, что ученым, вероятно, придется оптимизировать условия реакции, такие как соотношение праймеров к геномной ДНК.

Но, несмотря на то, что метод MALBAC более эффективен для секвенирования генома одной клетки, чем другие технологии, он тоже несовершенен. Он также пропускает около одной трети однонуклеотидных полиморфизмов. Кроме того, фермент ДНК-полимераза при амплификации ДНК совершает ошибки и может включить в новосинтезируемую цепь ошибочные нуклеотиды.

Се смог отсеять ошибочные варианты лишь путем сравнения отдельно секвенированных геномов трех клеток между собой. «Это увеличит стоимость и может оказаться невозможным для некоторых образцов тканей», - говорит Николас Навин (Nicholas Navin) из онкологического центра MD Anderson Cancer Center в Хьюстоне (Техас, США), разработавший свой собственный метод секвенирования генома одной клетки.

Для секвенирования ДНК одной клетки обычно необходим генетический материал множества клеток (фото: MEDICAL RF.COM/SCIENCE PHOTO LIBRARY)

По материалам NatureNews

Оригинальная статья: Nature doi:10.1038/nature.2012.12088

Литература:
1. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R. & Xie, X. S. Science 338, 1622–1626 (2012).