Биосенсорные экспресс-анализаторы в производстве спирта

Биосенсорные экспресс-анализаторы концентрации растворенных крахмала, глюкозы и этанола и активности ферментов для решения научных и практических задач спиртовой отрасли

А.Н.Решетилов, А.Е.Китова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН
142290, г. Пущино, Московская область, пр. Науки, 5

Известно, что оборудование основных участков спиртового производства оснащено в основном датчиками режимных параметров технологического процесса, такими как датчики температуры, давления, уровней, величины рН, а определение концентрации растворенного крахмала, сахаров и этанола проводится в настоящее время методами теххимконтроля в заводских лабораториях. Такой подход ограничивает возможности при построении и оптимизации систем автоматического контроля и управления технологическими процессами на отдельных участках спиртового производства.

Также известно, что качество технологических процессов при производстве спирта из крахмалосодержащего сырья практически на всех его этапах характеризуется динамикой изменения во времени таких параметров как концентрация растворенных крахмала, сахаров и этанола. Широкие возможности для измерения этих параметров открывают биосенсоры – аналитические приборы нового поколения, принцип действия которых основан на использовании свойств биологического материала.

Состав, принцип действия и области применения биосенсоров

Функционально биосенсор состоит из двух основных частей: рецепторного элемента (биологический материал в иммобилизованном состоянии) и физико-химического преобразователя, который служит для превращения биохимического сигнала в электрический. Сигнал биосенсора зависит от концентрации анализируемого вещества в измеряемом образце. В зависимости от типа биоматериала различают биосенсоры на основе ферментов, микробных клеток, тканевых культур, ДНК, иммунокомпонентов и органелл. Для регистрации сигнала биосенсора используются электрохимические (амперо-, потенцио– и кондуктометрические), оптические, калориметрические и акустические преобразователи, которые регистрируют такие параметры биохимических реакций, как появление электрохимически активных продуктов, изменение температуры, усиление или ослабление люминесценции [1].

Биосенсоры позволяют проводить непрерывный контроль биохимических процессов в биотехнологии, определять качество пищевых продуктов, их состав, содержание токсинов, антибиотиков, выполнять экологический мониторинг. Достижения в области биосенсоров, предназначенных для пищевой промышленности, отражены в ряде обзоров [2, 3]. Ферментные биосенсоры обычно используют для мониторинга низкомолекулярных соединений, таких как глюкоза, аминокислоты и антибиотики. Иммуносенсоры нашли широкое применение для детекции патогенных бактерий, токсинов и пестицидов в пищевых продуктах.

В качестве основы биорецептора сенсора широко используют клетки микроорганизмов. Микробные клетки – доступный биологический материал, дешевы, легко культивируются и поддерживаются в чистой культуре. В настоящее время разработаны микробные сенсоры для детекции сахаров, органических кислот, спиртов, витаминов, антибиотиков, пептидов, а также неорганических соединений (аммиак, нитраты, нитриты, сульфиды, сульфаты, фосфаты) [4, 5].

Биосенсоры для пищевой промышленности. Детекция крахмала, глюкозы и этанола

Ниже рассмотрены примеры биосенсорных систем для детекции крахмала, сахаров и этилового спирта.

Ферментные сенсоры для оценки содержания этанола могут быть основаны на алкогольдегидрогеназе либо на алкогольоксидазе, иммобилизованных на соответствующем преобразователе. Амперометрический биосенсор для определения этанола в парах на основе алкогольдегидрогеназы и никотинамидадениндинуклеотида ( NAD + ) в качестве кофактора представлен в работе [6]. Детекция этанола в парах была возможна в диапазоне 20-800 ppm . Этанольный биосенсор на основе алкогольоксидазы и кислородного электрода Кларка описан в работе [7]. Диапазон измерений охватывал область концентраций от 0.05 до 10 мМ.

Определение крахмала может осуществляться как с помощью ферментных сенсоров, так и сенсорами на основе клеток микроорганизмов. Как правило, схема анализа в этом случае включает гидролиз крахмала амилолитическими ферментами ( a-амилаза, глюкоамилаза) до глюкозы и последующую детекцию глюкозы амперометрическим сенсором на основе глюкозооксидазы или микробных клеток. Более того, для решения такой задачи, как оценка общего содержания утилизируемых сахаров в сбраживаемом сусле, использование биосенсора на основе микробных клеток может оказаться более предпочтительным, поскольку широкая субстрактная специфичность микроорганизмов может позволить выполнить интегральную оценку суммарного присутствия сахаров [8]. Ранее [9] был разработан гибридный сенсор мембранного типа на основе клеток B acillus subtilis и глюкоамилазы. Глюкоамилазная мембрана была предназначена для расщепления высокомолекулярных субстратов (декстрины) до низкомолекулярных продуктов (глюкоза), которые легко ассимилировались иммобилизованными на кислородном электроде микроорганизмами.

Кратко затрагивая экономическую сторону биосенсорной технологии отметим, что в настоящее время три конкурирующие фирмы – Эббот (Англия), Байер (Германия) и Бёрингер (Германия) являются доминирующими в производстве биосенсоров и в общей сложности выпускают около 85% всей биосенсорной продукции в мире. В целом современная биосенсорная техника развивается исключительно быстрыми темпами; созданы биосенсоры для определения более 100 различных веществ.

Следует подчеркнуть, что при объеме рынка биосенсорной технологии для пищевой промышленности 10 млн. долларов США в 1997 г., его объем на 2005 г. прогнозируется уже в 150 млн. долларов.

Основные требования к анализаторам состава и концентрации веществ в спиртовом производстве

Из вышеприведенного краткого обзора применения биосенсоров в пищевой промышленности, видно что часть из них с успехом может использоваться для решения научных и практических задач и в спиртовой отрасли.

Естественно также, что информация о концентрации растворенного крахмала, сахаров и этанола должна поступать от измерительных элементов и обрабатываться компьютером в режиме реального времени технологического процесса. В противном случае из-за длительности измерительного процесса получаемая информация настолько запаздывает, что лишь констатирует уже сложившееся состояние и не может быть использована для активного воздействия на технологический процесс [10].

В качестве примера рассмотрим задачу контроля концентрации спирта в бражке перед ее перегонкой. Зачастую те несколько часов, которые требуется для проведения соответствующего лабораторного анализа, приводят к невосполнимым потерям [11]. Аналогичные ситуации сопровождают и другие этапы спиртового производства.

Согласно отдельным положениям предлагаемой в [10] концепции развития аналитического приборостроения для АПК, приборы для пищевой промышленности (в том числе и для спиртовой отрасли) должны соответствовать следующим принципам:

•  конструкция приборов должна строиться по модульному принципу;
•  в основе принципа действия создаваемого прибора должна лежать его лимитная цена, стоимость одиночного анализа и обоснованная максимально допустимая погрешность результата измерений;
•  необходимо ориентироваться на создание приборов, позволяющих фиксировать кинетику (динамику) технологического процесса;
•  методики выполнения измерений должны быть максимально унифицированы.

Этим принципам в значительной степени удовлетворяют биосенсорные анализаторы. Кроме того, им присущи такие ценные для измерительных приборов качества как высокая чувствительность, селективность и простота аппаратурной реализации.

К таким биосенсорным анализаторам относится созданный при участии авторов аппаратно-программный комплекс, включающий прибор «БИОЛАН-1010» (рис. 1, А) и персональный компьютер.

[lib]spirt1.jpg[/lib]

А                                                                                         Б
Рис. 1. Внешний вид биосенсорных экспресс-анализаторов: А – «БИОЛАН-1010» для анализа крахмала, глюкозы, этанола и активности ферментов; Б – «БиоРАН-01» для экспресс-оценки индекса БПК.

Биосенсорный анализатор «БИОЛАН-1010». Основные технические характеристики

В табл. 1 в качестве примера приведены характеристики этого прибора для случаев, когда в качестве сменных модулей используются биорецепторы – мембраны с иммобилизованными на них биологическими материалами (ферментами или микроорганизмами), ориентированные на измерение концентраций растворенных крахмала, глюкозы и этанола.

Таблица 1

*Период измерения включает время анализа и время восстановления сигнала.

**Стабильность сенсора при проведении непрерывных измерений.

Методика измерений концентраций указанных веществ, реализованная в данном аппаратно-программном комплексе, была подробно описана в [12].

По мнению авторов, относительная погрешность в 2-5 % , диапазон измерений от 0.05 до 2.50 мМ, операционная стабильность от 4 до 10 суток и стабильность при хранении в 90 – 200 суток, являются вполне приемлемыми для целого ряда задач спиртовой отрасли, а период измерений от 5 до 15 мин при времени анализа от 60 до 200 сек, позволяют проводить указанные измерения в реальном масштабе времени технологических процессов спиртового производства. А это, в свою очередь, позволяет использовать биосенсорные анализаторы в качестве датчиков систем автоматического контроля и управления технологическими процессами на отдельных участках спиртового производства [13].

Предложенная в [9] схема биосенсорного анализа крахмала, может быть также применена и для оценки активности амилолитических ферментов. Так, например, биосенсор на основе ГОД был использован авторами для оценки активности глюкоамилазы (ГА). При проведении анализа в измерительную кювету объемом 2 мл ГОД сенсора вносили пробу, содержащую ГА (5 мкл, 1% раствор) и раствор крахмала (100 мкл, 1% раствор) в качестве субстрата. ГОД сенсор регистрировал накопление глюкозы, образующейся в результате расщепления крахмала амилазой – пример регистрации сигнала сенсора приведен на рис. 1. Гидролиз крахмала сопровождается снижением тока сенсора, что отражает увеличение концентрации глюкозы в измерительной кювете. Активность фермента выражали в миллиграммах образующейся глюкозы за промежуток времени ? t (см. рис. 1), равный 3 мин (данный критерий определения активности амилазных препаратов взят за основу и используется различными фирмами (см., например, каталог Sigma , 2004-2005). В рассмотренном примере суммарная активность глюкоамилазы, входящей в состав препарата «Алкоголаза II -400», составляла 0.54 Ед. активности, что в пересчете на единицу массы равно 10 Ед. активности/мг сухой массы.

[lib]spirt2.jpg[/lib]

Рис. 2. Ответ ГОД сенсора на введение 5 мкл 1% раствора препарата Алкоголаза II 400 и 100 мкл 1% раствора крахмала. Объем кюветы – 2 мл.

Рассматривая различные аналитические задачи, важные для спиртового производства, можно также отметить еще одну область эффективного использования биосенсорного анализа. Так, известно, что микробные биосенсоры позволяют выполнять экспресс-оценку БПК (биологического потребления кислорода), определяя данный индекс в сточных водах различных производств, муниципальных сточных водах и т. д. [14]. В спиртовом производстве спирта актуальной задачей является оценка БПК стоков, поскольку в данном случае индекс БПК определяется как наличием в стоках микрофлоры (дрожжевых клеток), так и наличием остаточной массы несброженных сахаров, крахмала. Для решения задачи быстрой оценки индекса БПК эффективным оказалось применение разработанного авторами анализатора «БиоРАН-01» – рис. 1 (Б) Он представляет собой микробный биосенсор электрохимического типа. Время измерения одной пробы не превышает 3-5 мин, что составляет значительную экономию времени и производственных затрат по сравнению с использованием традиционной методики БПК 5 .

Следует особо отметить, что для перехода на измерение других веществ или активности других ферментов, следует всего лишь произвести замену биорецептора; методика измерений при этом остается неизменной.

Использование биосенсорного экспресс-анализатора «БИОЛАН-1010» для решения задач спиртовой отрасли

С помощью прибора «Биолан-1010» возможно решение следующих задач, стоящих в настоящее время перед спиртовой отраслью:

•  анализ зерна на зараженность микотоксинами а также на содержание в нем крахмала и сахаров;
•  определение содержания растворенного крахмала на стадии его разваривания;
•  определение степени конверсии растворенного крахмала в сахара на стадии осахаривания крахмала;
•  определение бродильной активности дрожжей;
•  определение степени конверсии растворенных сахаров в этанол на стадии сбраживания сусла;
•  определение несброженных углеводов (крахмала и сахаров) и этанола в послеспиртовой барде;
•  определение активности ферментных препаратов;
•  определение концентрации этанола в сбраживаемом сусле и водно-спиртовых парах;
•  подбор оптимальных в заданном смысле марок и норм дозировок ферментных препаратов на различных стадиях технологического процесса;
•  обоснование целесообразности и оптимизация параметров нетрадиционных методов воздействия на зерно и полупродукты, таких как пародинамическая гомогенизация, экструзия, различные виды магнитных (электромагнитных) и электрических полей;
•  подбор оптимальных температурных режимов на различных стадиях технологического процесса.

Что касается прибора «БиоРАН-01», то он позволяет производить экспресс-оценку индекса БПК стоков спиртовых производств.

Решение перечисленных задач позволит осуществить рациональное использование сырьевых (зерна и ферментов) и энергетических (пар и электроэнергия) ресурсов и вплотную подойти к разработке и практической реализации системы комплексной автоматизации всего спиртового производства на базе современной компьютерной техники и технологий.

Литература
1 . Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж . Биосенсоры: основы и приложения. – М.: Мир, 1992. – 614 с.
2 . Решетилов А.Н. Модели биосенсоров на основе потенциометрических и амперометрических преобразователей для использования в медицине, биотехнологии, мониторинге объектов окружающей среды // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т . 32. № 1. С .78-93.
3 . Nakamura H., Karube I . Current research activity in biosensors // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377. P . 446–468.
4 . Решетилов А.Н., Лобанов А.В., Морозова Н.О., Греен Р.В., Леазерс Т.Д. Применение элементов теории распознавания образов для определения содержания этанола в смеси при помощи микробного сенсора // Сенсорные системы. 1998. № 4. Т . 12. С .486-495.
5 . D'Souza S.F. Microbial biosensors (review) // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. P. 337–353.
6 . Park Je-K., Yee H.-J., Lee K. S., Lee W.-Y., Shin M.-C., Kim T.-H., Kim S.-R. Determination of breath alcohol using a differential-type amperometric biosensor based on alcohol dehydrogenase // Anal. Chim. Acta. 1999. V. 390. P . 83-91.
7 . Морозова Н.О., Ашин В.В., Троценко Ю.А., Решетилов А.Н. Амперометрическое определение алифатических спиртов с помощью иммобилизованной алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia methanolica // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т.35. №5. С. 604-608.
8 . Решетилов А. Н., Китова А. Е., Алферов В. А., Понаморева О. Н., Кузмичев А. В., Ежков А.А. Ферментные и микробные сенсоры для анализа глюкозы и этанола // Биотехнология – 2003: Тез. докл. семинара-презентации инновационных науч.-техн. проектов. 24-25 нояб. 2003 г. – Пущино, 2003.– С. 64-65.
9 . Renneberg R., Riedel K., Liebs P., Scheller F. Microbial and Hybrid Sensors for Determination of a -Amylase Activity // Anal. Lett. 1984. V. 17 (B5). P . 349-358.
10 . Балашов В.М., Бегунов А.А. Состояние, концепция и принципы развития аналитического приборостроения для АПК // Пищевая промышленность. 2002. № 2. С. 68-69.
11 . Сергеев В.И. и др. Автоматизация технологических процессов в алкогольной промышленности // Ликероводочное производство и виноделие. 2002. № 5(29). С. 3.
12. Китова А.Е., Алферов В.А., Понаморева О.Н., Кузмичев А.В., Ежков А.А., Арсеньев Д.В. . Ре шетилов А.Н. Ферментные биосенсоры для экспресс-анализа содержания глюкозы, этанола и крахмала в ферментационных средах // Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. – М.: Пищепромиздат, 2004. С. 255-262.
13. Китова А.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Кузмичев А.В., Ежков А.А., Арсеньев Д.В., Решетилов А.Н. Перспективы применения биосенсорных экспресс-анализаторов при производстве спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий.– 2004. – №4.– С. 11-13.
14. Reiss M., Heibges A., Metzger J., Hartmeier W . Determination of BOD-values of starch-containing waste water by a BOD-biosensor // Biosens. Bioelectron. 1998. V. 13. P. 1083–1090.