Зайцев В.В.¹, кандидат ветеринарных наук, главный технолог
Дремач Г.Э.³, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры эпизоотологии
Зайцева А.В.³, аспирант кафедры микробиологии и вирусологии
Сафроненко Л.В.², кандидат технических наук, заведующая отделом микробиологии
Тункель В.С.¹, старший микробиолог
¹ УП «Витебская биофабрика» г. Витебск, Республика Беларусь
² РУП «Институт мясомолочной промышленности» г. Минск, Республика Беларусь
³ УО «Витебская государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь

В статье приведены сведения об отработке параметров культивирования сальмонелл, эшерихий, пастерелл, лептоспир, рожистых и молочнокислых бактерий в газовихревом биореакторе «Биок». Показана возможность использования газовихревого биореактора для создания новых биологических препаратов и бактериальных концентратов.

Ключевые слова: культивирование, газовихревой биореактор, сальмонеллы, эшерихии, пастереллы, лептоспиры, рожистые бактерии, молочнокислые бактерии.

Актуальность проблемы. Условия культивирования и, следовательно, выход целевого продукта в значительной мере определяется конструкцией биореактора, создающего оптимальные условия для роста и накопления бактериальной культуры.

Закрученные течения однофазных и многофазных сред широко используют в различных отраслях современной техники. Закручивание потока связано с необходимостью интенсификации процессов тепломассопереноса в энергетических установках или аппаратах химических технологий [2, 3, 4, 7]. В закрученном потоке интенсификация процессов переноса импульса, теплоты и массы вызвана в основном двумя причинами: изменением величины и направления скорости (влияния через средние характеристики течения); влиянием массовых сил на течение у твердых ограничивающих поверхностей.

В биореакторе «Биок» перемешивание суспензии бактериальных клеток осуществляют путем создания в ней квазистационарного вращательного движения, генерируемого аэрирующим газом, который подают в емкость над поверхностью суспензии клеток с одновременным его закручиванием в поток с полем скорости потенциального вихря на периферии емкости (зона I) и осевым противотоком в приосевой зоне (зона II); при этом перепад давления в потоке аэрирующего газа между периферией и центром вихря поддерживают в пределах 10-2000 Па [5].

Благодаря такому закручиванию аэрирующего газа за счет трения на границе раздела фаз и разницы давления между периферией и центром газового вихря обеспечивается движение суспензии клеток в виде вихревого кольца, вращающегося относительно оси емкости с одновременным нисходящим движением жидкости на периферии емкости (зона III) и восходящим – в приосевой зоне (зона IV). Аэрирующий газ взаимодействует с суспензией клеток только через свободную поверхность последней, не смешиваясь с ней. В результате этого обеспечивается интенсификация межфазного массообмена за счет увеличения скорости движения аэрирующего газа и равномерного перемешивания суспензии без застойных зон, снижение травмируемости клеток – за счет исключения при перемешивании зон с высоким уровнем турбулентности, и стабилизация пенообразования – вследствие разрушающего действия газового вихря на пену.

Энергия, необходимая для перемешивания суспензии клеток, подводится по всей поверхности жидкости, что позволяет реализовать режимы суспензионного культивирования любых культур, в том числе наиболее чувствительных к механическому воздействию [1, 6, 7].

Согласно данным И.Д. Воробьева с соавторами (1989), величина сульфатного числа в вихревом биореакторе зависит от объема заполнения, расхода воздуха над свободной поверхностью жидкой фазы и интенсивности газового вихря. Введение воздуха через пористое днище вихревого биореактора приводит к резкому (более чем в 10 раз) увеличению сульфатного числа [4].

Газовихревой биореактор позволяет начинать культивирование при минимальном заполнении (10-15%) и путем непрерывного добавления среды в процессе культивирования завершить его при максимальном заполнении (90%). Это свойство аппарата позволяет сократить, а в ряде случаев исключить линию биореакторов меньшего объема для запуска аппарата большего объема. Конструкция газовихревого аппарата проще, дешевле и менее энергоемка, чем традиционные конструкции с механической мешалкой.

Согласно полученным данным, в биореакторах «Биок» с газовихревым перемешиванием жидкости удельная мощность на перемешивание в 12-16 раз ниже, чем в биореакторах с мешалкой фирмы «Хемап» [2].

Задача исследования. Изучить возможность управляемого культивирования разных видов бактерий, используемых в производстве биологических препаратов и кисломолочных продуктов.

Материал и методы исследования. Работу осуществляли на газовихревом биореакторе «Биок» емкостью 5 дм³.

(Производитель – ЗАО «Саяны», 630090, Новосибирск а/я 355,
E-mail sajany@bioreactor.ru сайт www.bioreactor.ru
тел (383)306-26-20, 306-26-40)

При проведении исследований использовали производственные штаммы: Salmonella gallinarum-pullorum 24 КСТ, Pasteurella multocida suis № 877, Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2, E. coli №115, Leptospira рomona ВГНКИ-6, Lactococcus lactis subsp. lactis, L.lactis subsp. diacetilactis и Lactobacillus acidophilus.

Для выращивания бактерий использовали изготовленные нами питательные среды: для культивирования рожистых бактерий – производственную среду, полученную согласно заявке на изобретение № 20050681 (авторы Зайцев В.В., Дремач Г.Э.), лептоспир – модифицированную сывороточную среду (автор Зайцев В.В.), эшерихий, сальмонелл и пастерелл – накопительные среды на основе гидролизатов мяса, мясокостной муки и белков сыворотки крови (авторы Зайцев В.В., Дремач Г.Э., Зайцева А.В.), молочнокислых бактерий – гидролизатно-молочные питательные среды, полученные по технологии РУП «Институт мясомолочной промышленности».

Модифицированную сывороточную среду стерилизовали путем фильтрации через мембранный фильтр патронного типа (0,22 мкм).

Питательные среды для культивирования эшерихий, сальмонелл и пастерелл, питательную основу для выращивания рожистых бактерий фасовали в стеклянные баллоны емкостью 5 дм³, укупоривали ватно-марлевыми пробками, оборудованными стеклянным сифоном и канюлями, и стерилизовали при температуре 116-118°С в течение 45 минут.

Перед культивированием бактерий в предварительно смонтированный и простерилизованный при температуре 132°С в течение 2 часов газовихревой биореактор помещали: 2 дм³ питательной среды, соответствующей рецептуры, 0,2 дм³ посевного материала определенной культуры.

Процесс культивирования лептоспир в баллонах, применяемый в настоящее время в УП «Витебская биофабрика», непроизводителен, трудоемок и неэффективен. Он неуправляем и осуществляется без контроля и регулирования технологических параметров (за исключением температуры). Многочисленные операции с бутылями (монтаж, фильтрование среды, посев культур, отбор проб, составление серии) нередко приводят к загрязнению препарата, его выбраковке. Установленные на предприятии реакторы имеют ряд существенных конструктивных недостатков и не обеспечивают стабильной стерильности и регулирования технологических параметров.

При проведении запланированной работы лептоспиры засевали в баллон, содержащий модифицированную сывороточную питательную среду, до содержания 8 млн.м.к./см³. В течение 72 часов лептоспиры выращивали в баллоне при температуре 28°С. Далее культуру помещали в газовихревой биореактор и выращивали в течение 12 часов при температуре 28°С. Перемешивание среды осуществляли путем создания в ней трехмерного движения типа «вращающегося вихревого кольца» при 1200-1500 об/мин.

В процессе культивирования лептоспир определяли морфологию, продолжительность лаг-фазы, экспоненциальной фазы, максимальную удельную скорость роста, минимальное время генерации.

Рожистые бактерии выращивали в течение 4 часов без перемешивания. Учитывая, что эризипелотриксы являются микроаэрофилами, аэрацию не проводили. Через 4 часа произвели поверхностную продувку культуры воздухом в течение 3 минут в объеме 1 дм³/дм³. Рост осуществляли в течение 10 часов. В процессе культивирования учитывали морфологию, общую концентрацию возбудителя и количество жизнеспособных клеток. На протяжении всего процесса культивирования температуру поддерживали автоматически в пределах 37,0-37,5°С.

Пастереллы выращивали в течение 10 часов. Первые 3 часа культивирование осуществляли без аэрации при вращении активатора 1000 об/мин, при этом вращение плавающей шайбы составляло 35 об/мин. С 4 часа роста режим вращения активатора установили 1200 об/мин (вращение шайбы 40 об/мин). Через 4 часа скорость вращения активатора установили 1500 об/мин (вращение шайбы 48 об/мин). Выращивание микроорганизмов осуществляли при температуре 37,5-38,0°С. В процессе культивирования через 4, 6 и 10 часов проводили отбор проб культуры для проведения микроскопического исследования, определения концентрации и рН культуральной среды.

Эшерихии культивировали в течение 12 часов. После засева установили вращение активатора в биореакторе 2500 об/мин, подачу воздуха поверхностным способом в объеме 0,7-0,8 дм³/дм³/мин. Подачу воздуха в аппарат замеряли ратометром. В целях изучения влияния физико-химических параметров на рост эшерихий произвели культивирование на отдельных фазах роста при вращении активатора 2600, 2700, 2850 и 3000 об/мин. Через 7 часов роста выращивание вели при вращении активатора 2200-2500 об/мин. Через 10 часов роста в культуральную среду добавили 40%-ный раствор глюкозы из расчета 10 см³/дм³. В процессе культивирования через 4, 6, 8, 10 и 12 часов роста проводили отбор культуральной жидкости для определения концентрации микроорганизмов и рН.

Культуру сальмонелл выращивали в течение 12 часов при вращении активатора 1500 об/мин в течение 4 часов. Через 6, 8 и 10 часов роста добавляли 40%-ный раствор глюкозы соответственно в объеме 5, 10 и 8 см³ на литр культуральной среды. С 6 до 10 часов роста режим работы активатора составлял 2000 об/мин, а с 10 до 12 часов – 1800 об/мин. Аэрацию осуществляли комбинированно – поверхностным и глубинным способами, соответственно 1,2 дм³/дм³ и 0,6 дм³/дм³.

Процесс культивирования лактококков проводили при постоянном перемешивании (частота работы активатора 1200-1400 об/мин, или 27-36 об/мин шайбы) при подержании рабочей температуры 30°С и рН в диапазоне 6,2-6,8 путем добавления 40%-ного раствора гидроокиси натрия.

Лактобациллы выращивали при рН 5,63-6,15 при постоянном перемешивании (частота работы активатора 600-1600 об/мин) и температуре 37°С.

Выращивание микроорганизмов проводили без применения пеногасителя.

Результаты исследований. В ходе исследований установлено, что для культивирования лептоспир в ферментере необходимо использовать посевные культуры возбудителя в экспоненциальной фазе роста (72 часа роста).

Управляемое периодическое культивирование лептоспир в ферментерах газовихревого типа обеспечивает физиологически более активное состояние культур, увеличение максимальной скорости роста, минимальное время генерации по сравнению с традиционной технологией производства, интенсификацию процесса за счет уменьшения продолжительности выращивания лептоспир в 1,5 раза (с 168 часов до 128 часов). При этом наблюдали более высокое накопление клеток – 6,2×10⁸ м.к./см³ по сравнению с 0,9×10⁸ м.к./см³ при традиционной технологии.

В процессе культивирования эшерихий в аппарате «Биок» установили, что через 4 часа роста в культуральной среде содержалось 12 млрд.м.к/см³, рН – 7,2. Через 6, 8, 10 и 12 часов роста содержание клеток составило соответственно 15, 20, 23 и 25 млрд. При этом рН находилась в пределах 7,0-7,6. В ходе исследования также установлено, что при режиме вращения активатора с частотой 2700-3000 об/мин происходит мелкодисперсное вспенивание культуральной среды над вращающей шайбой аппарата. Такое явление приводит к подавлению роста, а использованная в нашем опыте поверхностная аэрация не обеспечивает эшерихий необходимым количеством растворимого кислорода.

По результатам проведенной работы считаем необходимым отметить, что выращивание эшерихий в газовихревом биореакторе целесообразно проводить путем подачи стерильного воздуха из расчета 1-2 дм³/дм³ через барботер или комбинированным способом. Скорость вращения активатора должна быть в течение первых 2 часов 2000 об/мин, а далее 2200 об/мин.

При выращивании рожистых бактерий нами установлено, что в аппарате обеспечивается стерильность процесса. Первые 4 часа рекомендуем процесс выращивания вести в покое, а далее в течение последующих 6 часов – при скорости вращения активатора 1500 об/мин. Культура рожистых бактерий обладает типичной морфологией и высокой жизнеспособностью. Общая концентрация микроорганизмов составила 8 млрд.м.к./см³. При этом жизнеспособность рожистых бактерий, полученных в аппарате газовихревого типа, была на 16% выше, чем при выращивании в стеклянном баллоне и биореакторе с механической мешалкой.

При выращивании пастерелл нами установлено, что процесс целесообразно вести первые 3-4 часа при вращении активатора с частотой 1000 об/мин, в последующем – 1200-1500 об/мин. Подачу воздуха необходимо осуществлять в объеме 1 дм³/дм³. Через 4 часа в культуральной среде содержался 1 млрд.м.к/см³, рН – 7,8; через 6 часов концентрация микроорганизмов составила 4 млрд.м.к/см³, рН – 6,9; через 10 часов – соответственно 8 млрд.м.к/см³ и 6,7. При проведении микроскопии мазков, приготовленных из культур, отобранных через 4, 6 и 10 часов культивирования и окрашенных по Граму установлено, что микроорганизмы имеют типичные морфологические свойства, характерные для данного возбудителя. Процесс культивирования следует проводить в течение 10 часов.

Выращивание сальмонелл необходимо осуществлять путем подачи воздуха в аппарат поверхностным и глубинным способами (через барботер) соответственно в объеме 1,2 и 0,6 дм³/дм³, скорости вращения активатора 1500-2000 об/мин и дробной подаче 40% раствора глюкозы при продолжительности роста 12 часов. При таком режиме культивирования накопление сальмонелл в аппарате «Биок» составило 24 млрд.м.к/см³, в то время как накопление культуры в биореакторе с механической мешалкой – 16 млрд.м.к/см³.

Для культивирования лактококков в ферментере необходимо использовать посевные культуры в экспоненциальной фазе роста (17 часов). Управляемое периодическое культивирование микробов в ферментерах газовихревого типа обеспечивает физиологически более активное состояние культур, увеличение максимальной скорости роста, минимальное время генерации по сравнению с традиционной технологией производства, интенсификацию процесса за счет уменьшения продолжительности выращивания лактококков на 12,5% (с 8 часов до 7 часов). При этом наблюдали более высокое накопление клеток – 1,6 х10¹⁰ КОЕ/см³, по сравнению с традиционной технологией (5,0×10⁹ КОЕ/см³).

В ходе исследования также установлено, что в фазе адаптации должен обеспечиваться режим вращения активатора 1200 об/мин (27 оборотов шайбы), а при вхождении в логарифмическую стадию роста – 1400 об/мин (36 оборотов шайбы). С учетом имеющихся теоретических данных был построен режим перемешивания с поэтапным увеличением частоты работы активатора начиная с 600 об/мин (8 оборотов шайбы) до 1400 об/мин (36 оборотов шайбы).

Выводы:

1. Биореактор «Биок» с газовихревым перемешиванием позволяет культивировать разные патогенные бактерии глубинным способом без использования пеногасителя и обеспечивать аэрацию культуральной среды как глубинным, так и поверхностным способом.
2. Газовихревой биореактор осуществляет мягкое, но эффективное перемешивание без образования пены, гидроударов, кавитации, высокотурбулентных и застойных зон. В тоже время газовый вихрь является эффективным пеногасителем.
3. Биореактор легко масштабируется и может обеспечить управляемость процесса культивирования по следующим параметрам: рН, еН, рО₂, t°С.
4. Биореактор обеспечивает ведение стерильного процесса культивирования, легко управляем при монтаже и обслуживании. При работе с ним не требуется переподготовка персонала, работающего на аппаратах с механическим перемешиванием.
5. Аппарат газовихревого типа позволяет оптимизировать процесс культивирования, создать щадящие условия процесса, избежать лизиса культур и обеспечить их высокую жизнеспособность.
6. Использование биореактора «Биок» обеспечивает увеличение выхода целевого продукта, что позволяет сократить количество аппаратов для культивирования (по сравнению с биореакторами с механическим перемешиванием) и уменьшить количество производственных площадей. Возможна работа аппарата при заполнении в пределах 10-90%. Аппарат потребляет на перемешивание в 5-6 раз меньше энергии, чем аппараты с мешалкой.
7. В процессе культивирования микроаэрофилов (лактобацилл) за счет высокого поверхностного массообмена при неполном заполнении биореактора наблюдалась задержка роста микроорганизмов, вызванная ингибированием кислородом. При дальнейшей работе рекомендуем проводить стерильную продувку инертным газом в целях создания анаэробных условий и предотвращения токсического воздействия кислорода на лактобациллы.
8. Использование биореактора в научных исследованиях позволит разработать и организовать производство новых биологических препаратов, повысить стабильность и количество доз в сухих живых вакцинах, а также снизить их реактогенность и повысить биологическую эффективность и технологичность производства.
9. Используя биореакторы нового типа, можно разработать и организовать производство новых бактериальных концентратов и повысить стабильность их количественных показателей.

Литература

1. Аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей или микроорганизмов / В.И. Кислых, А.П. Репков, Ю.А. Рамазанов, И.Д. Воробьев // Патент России № 2099413. Опубликован 20.04.1997.
2. Виестур, У.Э. Культивирование микроорганизмов / У.Э. Виестур, Н.Ж. Кристансонс. – М.: Пищевая промышленность, 1980. – 231 с.
3. Вихревой биореактор «Биок» 1. Опыт культивирования штамма E. coli BL 21 (ДЕ 3) рZZSA, продуцирующего рекомбинантный антиогенин человека / В.И. Кислых [и др.] // Биотехнология. – 2000. – № 4. – С. 72-79.
4. Воробьев, И.Д. Массообмен в клеточном культиваторе «Биоколь». Гидродинамика и процессы переноса в биореакторах / И.Д. Воробьев, В.И. Кислых, В.А. Харченко. – Новосибирск, 1989. – С. 35-40.
5. Газовихревые биореакторы «Биок». Использование в современной биотехнологии / Н.П. Мертвецов и др. – Новосибирск: Наука, 2002. – 118 с.
6. К вопросу о моделировании течений в вихревой камере: Материалы межд. конф. «Математические модели и методы их исследования (задачи механики сплошной среды, экологии, технологических процессов) / Т.И. Зеленяк [и др.]. – Красноярск, Россия, 25-30 августа 1997. – Красноярск, 1997. – С. 37-43.
7. The production of cell in air-vortex stirred bioreactors / B.S. Baibakov [et al.] // International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, June, 12-18, 1991. – Leningrad, 1991. – P. 234-238.

Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/