Искусственно эволюционированные вирусы для генной терапии

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой безвредный вирус, присутствующий в организмах 90% людей. В последнее время он рассматривается как потенциальный вектор – переносчик генов – для осуществления генной терапии. Однако проблема заключается в том, что в организме подавляющего большинства людей содержаться антитела к AAV, отслеживающие и нейтрализующие частицы вируса сразу же после их попадания в организм, что лишает смысла всякие попытки проведения генной терапии с его помощью.

Исследователи Калифорнийского университета (г. Беркли) под руководством Дэвида Шафера (David Schaffer) решили попытаться ускорить эволюцию AAV и направить этот процесс таким образом, который позволил бы вирусу получить способность проскальзывать мимо иммунной системы человека и, таким образом, повысил бы его ценность в качестве генного вектора.

До сих пор направленная эволюция использовалась в основном для изменения активности ферментов (повышения их эффективности в отношении нового субстрата или усиления каталитической активности) и для улучшения способности антител связываться со специфическими мишенями. В отношении вирусов подобные подходы никогда ранее не использовались.

Частица AAV состоит всего из двух генов, покрытых белковой оболочкой – капсидом. Белки капсида распознаются антителами, именно поэтому они были выбраны в качестве мишени для направленной эволюции (участки молекулы белка, распознаваемые иммунной системой, на «портрете» аденоассоциированного вируса обозначены желтым). Для обеспечения первичного материала эволюции – генетических вариаций, из которых природа выбирает наиболее жизнеспособные, – исследователи создали мутантные вирусы путем индукции небольших изменений в их генах с помощью подверженной ошибкам ПЦР в комбинации с методом искусственной рекомбинации. После этого мутантные вирусные частицы помещались в сыворотку крови кроликов, иммунизированных против AAV, содержащую большое количество специфических к нему антител. В результате выживали только вирусы, несущие мутации, позволяющие им избегать взаимодействия с антителами.

После трехкратного пропускания вирусных частиц через сыворотку, концентрация антител в которой повышалась с каждым раундом, выжившие вирусные частицы были выделены и снова подвергнуты ПЦР, что привело к появлению новых мутаций. Второе поколение вирусов-мутантов также прошло через три этапа взаимодействия с иммунными сыворотками. Полученные в результате этого «искусственного-естественного» отбора частицы аденоассоциированного вируса обладали гораздо более выраженной способностью избегать встречи со специфическими антителами, чем частицы природного штамма. Один из полученных штаммов выживал почти в 2 раза лучше, чем его предок, а еще два выжили в организмах мышей, в сыворотке крови которых концентрация антител к природному штамму была почти в 1000 раз выше, чем необходимо для уничтожения вируса.

С помощью секвенирования генома наиболее устойчивых вариантов вируса ученые установили, что белки капсида новых штаммов отличались от первоначальных белков, состоящих примерно из 1500 аминокислот, только семью аминокислотами, две из которых ответственны за нарушение процесса взаимодействия с антителами.

Работа над одним вирусным поколением занимает около месяца, поэтому авторы надеются в течение ближайшего года создать большое количество новых усовершенствованных штаммов. Кроме того, они планируют начать эксперименты с использованием человеческой сыворотки.

Использование этой методики может быть также успешно использовано для улучшения других характеристик аденоассоциированного вируса, необходимых для его успешного использования в качестве генного вектора.

Конечно, существует еще целый ряд проблем, которые должны быть решены, например, как научить вирус проникать в те клетки, которые он обычно не проникает, или как ускорить процесс его продвижения в организме.

Кроме всего прочего, авторы работы осознают, что новая методика может быть использована для искусственного повышения патогенности опасных для человека вирусов, однако, по словам Дэвида Шафера, в мире уже существуют другие, более легкие методики, которые могут быть использованы в этих целях.

Статья Narendra Maheshri et al. «Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors» опубликована в февральском номере журнала Nature Biotechnology.

Интернет-журнал "Коммерческая биотехнология" http://www.cbio.ru/