Амплификация в реальном времени: важно количество

Важно не только ответить на вопрос, есть ли в организме возбудители какого-либо заболевания, но и точно установить их концентрацию. Только зная это, можно верно поставить диагноз и прогнозировать реакцию организма на терапевтические меры. А для этого необходимо усовершенствовать давно применяемую методику – разработать и внедрить в медицинскую практику новые диагностические методы, а также аппаратуру, основанную на принципах амплификации в реальном времени и флуоресцентной детекции.

Десять лет назад был расшифрован геном человека. Ученые научились «разворачивать» спираль молекулы ДНК и синтезировать ее зеркальное отражение – комплиментарную ей цепь. Стало возможным диагностировать наследственные заболевания, следить за мутациями, идентифицировать личность человека. Еще проще – идентифицировать бактерии и вирусы, потому что их наследственная информация, их ДНК, короче. Что это дает, где это можно использовать?

Допустим, медикам нужно убедиться, что кровь, которую будут использовать для переливания, не заражена вирусом иммунодефицита человека. Совсем недавно для этого устанавливали, не содержит ли эта кровь антител к вирусу СПИДа. Но ведь иммунная система начнет производить антитела для уничтожения вируса лишь через несколько месяцев после инфицирования, а до тех распознать кровь как инфицированную невозможно. К сожалению, порой это приводило к трагедии. Всё сказанное относится также и к вирусам гепатита, и ко многим другим возбудителям. Понятно, что возможность находить в организме сам вирус, а не его антитела, делает диагностику гораздо более своевременной и точной. Именно эту задачу можно выполнить с помощью синтеза спирали ДНК. Если эту цепь сделать флуоресцентной и добавить к анализируемому образцу, то при наличии уникальных фрагментов, свойственных тому или иному виду бактерий или вирусов, они свяжутся, однозначно констатируя присутствие этого вируса в организме. Эта технология получила название полимеразной цепной реакции (ПЦР), или амплификации. Особенность метода такова, что количество молекул в исследуемом образце с помощью специального прибора (амплификатора) можно увеличивать в миллиарды раз, а затем определять вирусы и бактерии с точностью до штамма, выделяя подвиды, например, чувствительные или нечувствительные к тем или иным антибиотикам. Кроме того, метод полимеразной цепной реакции абсолютно специфичен, чего нельзя сказать об иммунологических методах.

Метод ПЦР начал применяться в России около 15 лет назад. Последние 7-10 лет терапевты, урологи, венерологи, гинекологи отправляют на такой анализ пациентов с подозрением на кожные и уро-генитальные инфекции, заболевания иммунодефицитом и гепатитами, чтобы не ошибиться в диагнозе и не назначить ошибочно дорогостоящее лечение, которое может повредить больному. Ситуацией тут же воспользовались предприниматели: по всей стране малые частные предприятия начали предлагать услуги этого анализа, разрабатывая свой диагностикум на отдельные фрагменты ДНК. Многие из них не были лицензированы, оценка их качества проводилась не всегда.

К счастью, со временем мелкие фирмы стали вытесняться сильными компаниями, имеющими все необходимые разрешения, и ситуация нормализовалась. Однако возникла другая проблема: чувствительность описываемого метода столь высока, что порой имели место ложноположительные реакции. То есть диагностикум однозначно фиксирует наличие в организме возбудителей той или иной болезни, не определяя его количественное содержание в исследуемом образце. А, как известно, многие бактерии существуют в симбиозе с организмом человека и, при определенном уровне содержания в крови и других жидкостях, в тканях и на поверхности кожи, даже полезны. Из 3 тысяч видов бактерий, «сосуществующих» с нашим организмом, до видового уровня исследованы только 10%. В отношении остальных ученые пока затрудняются дать ответ, случайны ли они или соучаствуют в каких-либо обменных процессах организма человека. Ведь хорошо известно, например, что во время приема антибиотиков, уничтожающих определенные виды бактерий, у человека может ослабеть иммунитет, хуже работает кишечник, слезятся глаза, становится сверхчувствительной кожа… Очевидно, что важно не только ответить на вопрос, есть ли в организме возбудители какого-либо заболевания, но и точно установить их концентрацию. Только зная это, можно верно поставить диагноз и прогнозировать реакцию организма на терапевтические меры. А для этого необходимо усовершенствовать давно применяемую методику – разработать и внедрить в медицинскую практику новые диагностические методы, а также аппаратуру, основанную на принципах амплификации в реальном времени и флуоресцентной детекции. Именно такую задачу поставила Федеральная целевая научно-техническая программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", добавив к этому «разработку отечественных приборов и технологий для детекции генетических нарушений». Дело в том, что в отношении продуктов питания метод ПЦР в реальном времени действует аналогично: не просто устанавливает, был ли продукт модифицирован на генном уровне, но и определяет количественную долю этих изменений. А это крайне важно: незначительной модификации сегодня подвержена большая часть продуктов, однако в отношении тех, в которых эти изменения достигают заметной доли, необходимо корректировать как нормы употребления, так и их стоимость. Конкурс на разработку и создание приборов и диагностик, решающих эти задачи, выиграли сотрудники Факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Приборы, о которых идет речь, уже существуют – немецкие, австралийские… Но, конечно, очень дорогие. Три-четыре года назад стали появляться первые отечественные аналоги. Их разрабатывали, в основном, маленькие частные фирмы, невысокие накладные расходы которых позволяли выходить на рынок с низкими ценами. Однако никакой комплексной проверки качества и надежности этих приборов не проводилось, и возникла необходимость, проанализировав имеющиеся предложения, рекомендовать к использованию единый унифицированный вариант.

- Это не новое знание, даже не новая технология, это задача, выросшая из жизни, - говорит ответственный руководитель проекта декан Факультета фундаментальной медицины МГУ Всеволод Ткачук. – Нам выделили деньги на конкретную задачу: создание недорогих и надежных диагностикумов и приборов, унифицированных для всей страны. При этом дело здесь не просто в удобстве использования или экономичности. В конечном счете, это вопрос государственной безопасности, ведь речь идет об инфекционных болезнях. Государству необходимы методы раннего выявления инфекций, причем унифицированные, чтобы в Хабаровске и в Калининграде использовались одни и те же методы, диагностикумы и приборы, иначе трудно сопоставить результаты, и качественные, и количественные.

На сегодня коллектив Факультета фундаментальной медицины МГУ уже выполнил задание первого этапа. Созданы молекулы, которые специфически распознают нужные фрагменты ДНК в бактериях и вирусах, отработана полимеразная цепная реакция, сконструирован прибор для измерения ПЦР в реальном времени. Инфекционисты теоретически проработали безопасные и критические уровни бактерий или вирусов для разных возбудителей. Результатом стал набор реагентов и методика их применения. Следующий этап – переход на такой технологический уровень, когда прибор и реагенты правильно использовать мог бы любой лаборант. Ошибка – даже одна из ста! – может привести к трагедии: кому-то перельют зараженную ВИЧ кровь или, наоборот, здоровому человеку объявят о наличии у него смертельной болезни. Уже в этом году на Факультете фундаментальной медицины МГУ доведут технологию до уровня, обеспечивающего в рутинном исполнении абсолютную точность и воспроизводимость. В разработке этой технологии участвовало около десятка партнеров факультета.

- Соисполнителей я подбирал сам, и это – неоспоримый плюс этой программы, - говорит Всеволод Арсеньевич. – Такой подход влечет за собой много хлопот и много ответственности. Каждого соисполнителя я согласовывал с Министерством образования и науки, подробно докладывал, что для выполнения такого-то этапа мне нужен тот-то, аргументировал, почему именно он способен выполнить эту задачу. Министерство запрашивало лицензию соисполнителя на такой-то вид деятельности, его устав, налоговую историю – сколько лет он работает в данной области, сколько денег и от кого он получал, как их тратил, не был ли подвергнут каким-либо штрафам, налоговым преследованиям. Это увеличивало и без того огромную письменную отчетность. При этом ответственность за всю работу, за конечный результат лежит на мне. Конечно, это большая, хлопотная работа. Но если бы соисполнителей предлагало Министерство, я бы не взялся за это дело. Не потому, что не доверяю Министерству. А потому что могло получиться как у Райкина: «К пуговицам претензии есть? Нет? А за весь костюм я не отвечаю». Нам заказали костюм и дали на него деньги. И спросят за результат, за готовый «костюм». Поэтому именно мы должны выбрать людей, которым доверяем, в профессионализме и надежности которых мы уверены. Если обещанное финансирование будет своевременно выделено в полном объеме, мы выполним свои обязательства. Очень много времени уходит на работу с бумагами. Отчет за первый год составил около 600 страниц с картинками, таблицами, описанием методик. По объему это больше докторской диссертации!

Почитав требования к участникам конкурса, не каждый возьмется за эту работу. Там есть куча пунктов «бюрократических»: параллельно с основным заданием нужно еще провести столько-то конференций, защитить столько-то кандидатских и докторских диссертаций, провести столько-то конкурсов. По-видимому, Министерство хочет, чтобы за счет этих денег заодно был хоть немного подтянут и образовательный процесс. Это вполне здравый ход. Что же касается тщательной отчетности - это защита бюджетных денег и государственных интересов. Заказ ведь не на фундаментальные исследования, которые не нами начаты и не нами будут закончены, а на конкретные прибор и диагностикумы. Если у тебя не работает молодежь, не побеждают в конкурсах молодые ученые, не защищаются диссертации, если тебя никто не знает в научном мире, откуда возьмется уверенность, что ты выполнишь основное задание? Это защита от того, что эти деньги пойдут в учреждения, где никогда такой работой не занимались и начали с нуля. Во всяком случае, это отсекает слабых претендентов, мелкие учреждения.

Впрочем, среди претендентов конкуренты были сильные.

- Были, возможно, и сильнее нас, и послабее, но отбор был очень многофакторный, - говорит Всеволод Арсеньевич. – Рецензенты заполняли целые таблицы по разным показателям – интеллектуальным, производственным, научным, педагогическим. Все это имело свои баллы. Такая многофакторная система и вывела нас на первое место. Однако я считаю, что конкурс мог бы быть еще более открытым. Времени на написание заявки было очень мало, не все даже знали о конкурсе. Надо было бы дать на это несколько месяцев, объявить в газетах, а не только в Интернете. Хотелось бы, чтобы имена экспертов, которые оценивают конкурсантов, были известны, чтобы можно было читать лучшие заявки и совершенствовать свои.

Елена Укусова, Центр "Открытая экономика"