Новые подходы к лечению СПИДа
01.02.2006
5033
0
50330
Сегодня наиболее распространенные и опасные вирусные инфекции – это ВИЧ и гепатит. Эпидемиологическая ситуация последнего десятилетия в России характеризуется прогрессирующим увеличением числа больных СПИДом. На начало 2005 г. в нашей стране зарегистрировано более 300 тысяч ВИЧ-инфицированных. Однако есть все основания полагать, что их реальное число достигает одного миллиона.
Борьба с вирусными инфекциями в настоящее время становится одной из главных задач медицины. Для лечения вируса иммунодефицита человека в мире зарегистрировано около двадцати препаратов. По механизму действия и особенностям химического строения они разделяются на три группы: нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы. Для проведения терапии, как правило, используются комбинации из этих лекарств.
Несмотря на солидный перечень коммерческих препаратов, ученые всего мира продолжают разрабатывать все новые и новые противовирусные средства. Годовая стоимость лечения одного больного составляет $5000. При этом использование всех указанных лекарств и их комбинаций не позволяет полностью излечить человека, а только препятствует прогрессированию заболевания и предполагает проведение пожизненной терапии.
Принципиально новым и наиболее перспективным направлением лечения ВИЧ-инфекции сегодня является генотерапия. В результате реализации этого подхода возможно как полное излечение больных СПИДом, так и создание популяции, устойчивой к данному вирусу. Основа современной генотерапии – применение природных механизмов клетки, регулирующих экспрессию генов. На сегодняшний день наиболее изучены механизмы эпигенетического сайленсинга генов (от англ. silence – молчание). К ним относятся РНК-интерференция (защитный механизм, блокирующий работу строго определенных генов и не позволяющий им работать) и хромосомный сайленсинг.
Новые методы генотерапии
Этапы ВИЧ-инфекции, на которых ее возможно заблокировать с помощью siRNA (показаны красными крестами).
Российские ученые из Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (Москва) предложили использовать РНК-интерференцию для блокирования экспрессии генов ВИЧ-1. Совместно с Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Новосибирск) были получены первые генетические конструкции, способные с помощью РНК-интерференции ингибировать продукцию ВИЧ-1 в клетках человека. Результаты исследований были доложены бывшему в то время министру здравоохранения США Томасу Томсону во время его визита в Россию в 2004 г. и получили высокую оценку. Сегодня группа этих исследователей совместно со специалистами из Новосибирского государственного университета разрабатывает новые подходы для генотерапии СПИДа. Цель ученых – создание генетических кассетных конструкций, предназначенных для экспрессии малых интерферирующих РНК (siРНК). Эти siРНК, имеющие длину в 21 нуклеотид, служат «наводчиками», которые узнают только мРНК вируса и вызывают их деградацию. Оказалось, что лишь немногие siРНК биологически активны. Одна из основных задач проекта состоит в выявление экспериментальным путем наиболее активных последовательностей siРНК.
Преимущество данного подхода заключается в том, что он может быть использован для сайленсинга любых генов, вовлеченных в развитие патологии, а также позволяет разработать средство, пригодное как для лечения уже заболевших людей, так и для создания популяции, невосприимчивой к ВИЧ.
В отличие от зарубежных лабораторий, проводящих аналогичные исследования и применяющих для оценки противовирусного эффекта молекулярные клоны ВИЧ-1, в работе российских ученых по тестированию siРНК использовались лабораторные вирусные штаммы. Проведение таких исследований более трудоемко, так как предполагает работу с живым вирусом. Тем не менее, подобная модель эксперимента наиболее адекватна, если учитывать уникальное свойство вируса иммунодефицита человека – постоянное изменение его генетической структуры. Ученые уже доказали, что различные вирус-специфические siРНК обладают разной эффективностью подавления репродукции ВИЧ-1 на культуре клеток человека. Созданы две генетические конструкции, которые кодируют пока только две (отобранные из многих) siРНК, эффективно ингибирующие продукцию вируса.
Новые генетические конструкции
РНК-интерференция – природный механизм, обеспечивающий физиологическую регуляцию работы генов, а также защиту клеток от экспрессии чужеродной ДНК и РНК. Она отвечает за мощное и специфическое подавление экспрессии генов, транскрипты которых вовлечены в образование дуплексов РНК. Ключевым элементом в механизмах РНК-интерференции служат так называемые малые интерферирующие РНК (siРНК). Они обеспечивают узнавание молекул РНК, вовлеченных в образование дуплексов, а комплекс белков, в который входит siРНК, нарезает данные РНК до размеров siРНК (см. рисунок). В результате данный вид РНК практически полностью деградирует и экспрессия соответствующего гена блокируется.
В клетке чужеродные или «неправильные» дуплексы РНК (дсРНК) запускают мощный механизм РНК-интерференции. На первом ее этапе белок Дайсер нарезает дсРНК на «кубики», содержащие короткие 21-нуклеотидные фрагменты РНК. Затем такие кубики захватываются комплексом белков – RISC (RNA induced silencing complex). В нем дуплекс коротких РНК расплетается, и лишь одна цепь siРНК остается в нем. Далее RISC ведет сканирование молекул РНК клетки, с помощью siРНК-наводчика находит комплементарную последовательность нуклеотидов в соответствующей мРНК и разрезает ее.
Российские ученые планируют создать эффективно работающие генетические конструкции, так называемые кассеты. Они способны кодировать набор siРНК, подавляющих продукцию ВИЧ-1 в клетках человека, несмотря на появление нуклеотидных замен в каких-то отдельных мишенях вируса. Данные об эффективных siРНК позволяют также выбрать их последовательности для химического синтеза олигонуклеотидов ДНК и РНК.
Основным фактором, определяющим эффективность siРНК как эффективного «наводчика», служит правильный выбор мишеней – последовательностей в геноме ВИЧ-1. Для выбора наиболее перспективных мишеней ДНК ВИЧ-1 синтезируются олигонуклеотиды ДНК, соответствующие различным областям вирусного генома, и создаются конструкции, которые обеспечивают экспрессию siРНК в клетках. Затем проводится функциональный анализ активности siРНК-конструкций в первичных векторах, способных экспрессировать РНК-шпильки, из которых в клетках образуются siРНК. Для такого анализа российские специалисты создали тест-систему, позволяющую регистрировать интерференцию, направленную на определенные районы вирусного генома. В Институте молекулярной биологии исследователи применяют безвирусную систему, в которой в качестве репортерного гена используется ген люциферазы из коралла, слитый с выбранным фрагментом генома ВИЧ-1, а также ген люциферазы светлячка. При ко-трансфекции с первичными конструкциями, кодирующими siРНК, эффект РНК-интерференции регистрируется по снижению свечения репортерной коралловой люциферазы. А экспрессия светлячковой люциферазы служит внутренним контролем.
Применяя такую систему, можно провести скрининг различных конструкций и получить количественные данные об эффективности РНК-интерференции. Несомненное достоинство подхода состоит в том, что он не требует работы с вирусом, а предполагает использование лишь разных коротких областей его генома, полученных с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Кассетные конструкции
Для вируса иммунодефицита человека первого типа характерно быстрое возникновение и отбор мутантных вариантов, обладающих резистентностью к различным противовирусным препаратам. Для решения проблемы вирусной изменчивости ученые разработали и создали кассетные конструкции, стабильно экспрессирующие одновременно несколько siРНК. Затем, после оценки экспрессии сложных кассетных конструкций в безвирусной системе, разработчики использовали вирусную модель – культуру клеток человека, инфицированную различными штаммами ВИЧ-1, в частности, штаммами, репродуцирующимися по типу острой и хронической инфекции. Такой подход позволяет проводить исследования, приближенные к реальным процессам развития ВИЧ-инфекции в организме. Применение лабораторных штаммов ВИЧ-1 (в отличие от молекулярных клонов вируса) дает возможность оценивать влияние интерферирующих РНК на естественный пул вирусной популяции, заведомо обладающий генетическим разнообразием. Это также допускает проведение более объективной оценки противовирусной эффективности генетических конструкций.
Эффективность влияния различных конструкций ДНК и РНК оценивается по их способности подавлять репродукцию вируса в культуре клеток человека. Имея большой опыт работы по исследованию влияния различных противовирусных препаратов на репродукцию ВИЧ-1, российские ученые широко используют разработанную ими тест-систему для количественного определения вирусного антигена р24, которая позволяет достоверно оценивать интенсивность развития ВИЧ-инфекции в клетках.
Возможно, в скором будущем уже начнется работа по практическому использованию полученных результатов в генотерапии СПИДа. Достоинство разработанного метода состоит в использование биологических данных об эффективных последовательностях siРНК для экспрессии этих siРНК in vivo, а также для химического синтеза биологически значимых последовательностей в виде модифицированных препаратов РНК. Разработка российских ученых – это новый подход для лечения ВИЧ-инфекции.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
О федеральной целевой научно-технической программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы».
Михаил Алфимов, председатель Российского фонда фундаментальных исследований, aкадемик РАН:
– Есть еще один важный положительный фактор реализации ФЦНТП. Научное сообщество – это самоорганизующаяся структура, она начинает ориентироваться на то, что названо приоритетом. Академическая и вузовская наука имеют другие источники финансирования, но государство дало им сигнал, где требуются знания. На мой взгляд, схема менеджмента Программы выстроена правильно. Так построены системы госзаказа в научно-технической сфере во всех передовых странах.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Татьяна Бархатова, [url=www.sciam.ru/]«В МИРЕ НАУКИ»[/url], № 11-2005
Национальный информационный центр по науке и инновациям Sciencerf.ru
Борьба с вирусными инфекциями в настоящее время становится одной из главных задач медицины. Для лечения вируса иммунодефицита человека в мире зарегистрировано около двадцати препаратов. По механизму действия и особенностям химического строения они разделяются на три группы: нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы. Для проведения терапии, как правило, используются комбинации из этих лекарств.
Несмотря на солидный перечень коммерческих препаратов, ученые всего мира продолжают разрабатывать все новые и новые противовирусные средства. Годовая стоимость лечения одного больного составляет $5000. При этом использование всех указанных лекарств и их комбинаций не позволяет полностью излечить человека, а только препятствует прогрессированию заболевания и предполагает проведение пожизненной терапии.
Принципиально новым и наиболее перспективным направлением лечения ВИЧ-инфекции сегодня является генотерапия. В результате реализации этого подхода возможно как полное излечение больных СПИДом, так и создание популяции, устойчивой к данному вирусу. Основа современной генотерапии – применение природных механизмов клетки, регулирующих экспрессию генов. На сегодняшний день наиболее изучены механизмы эпигенетического сайленсинга генов (от англ. silence – молчание). К ним относятся РНК-интерференция (защитный механизм, блокирующий работу строго определенных генов и не позволяющий им работать) и хромосомный сайленсинг.
Новые методы генотерапии
Этапы ВИЧ-инфекции, на которых ее возможно заблокировать с помощью siRNA (показаны красными крестами).
Российские ученые из Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (Москва) предложили использовать РНК-интерференцию для блокирования экспрессии генов ВИЧ-1. Совместно с Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Новосибирск) были получены первые генетические конструкции, способные с помощью РНК-интерференции ингибировать продукцию ВИЧ-1 в клетках человека. Результаты исследований были доложены бывшему в то время министру здравоохранения США Томасу Томсону во время его визита в Россию в 2004 г. и получили высокую оценку. Сегодня группа этих исследователей совместно со специалистами из Новосибирского государственного университета разрабатывает новые подходы для генотерапии СПИДа. Цель ученых – создание генетических кассетных конструкций, предназначенных для экспрессии малых интерферирующих РНК (siРНК). Эти siРНК, имеющие длину в 21 нуклеотид, служат «наводчиками», которые узнают только мРНК вируса и вызывают их деградацию. Оказалось, что лишь немногие siРНК биологически активны. Одна из основных задач проекта состоит в выявление экспериментальным путем наиболее активных последовательностей siРНК.
Преимущество данного подхода заключается в том, что он может быть использован для сайленсинга любых генов, вовлеченных в развитие патологии, а также позволяет разработать средство, пригодное как для лечения уже заболевших людей, так и для создания популяции, невосприимчивой к ВИЧ.
В отличие от зарубежных лабораторий, проводящих аналогичные исследования и применяющих для оценки противовирусного эффекта молекулярные клоны ВИЧ-1, в работе российских ученых по тестированию siРНК использовались лабораторные вирусные штаммы. Проведение таких исследований более трудоемко, так как предполагает работу с живым вирусом. Тем не менее, подобная модель эксперимента наиболее адекватна, если учитывать уникальное свойство вируса иммунодефицита человека – постоянное изменение его генетической структуры. Ученые уже доказали, что различные вирус-специфические siРНК обладают разной эффективностью подавления репродукции ВИЧ-1 на культуре клеток человека. Созданы две генетические конструкции, которые кодируют пока только две (отобранные из многих) siРНК, эффективно ингибирующие продукцию вируса.
Новые генетические конструкции
РНК-интерференция – природный механизм, обеспечивающий физиологическую регуляцию работы генов, а также защиту клеток от экспрессии чужеродной ДНК и РНК. Она отвечает за мощное и специфическое подавление экспрессии генов, транскрипты которых вовлечены в образование дуплексов РНК. Ключевым элементом в механизмах РНК-интерференции служат так называемые малые интерферирующие РНК (siРНК). Они обеспечивают узнавание молекул РНК, вовлеченных в образование дуплексов, а комплекс белков, в который входит siРНК, нарезает данные РНК до размеров siРНК (см. рисунок). В результате данный вид РНК практически полностью деградирует и экспрессия соответствующего гена блокируется.
В клетке чужеродные или «неправильные» дуплексы РНК (дсРНК) запускают мощный механизм РНК-интерференции. На первом ее этапе белок Дайсер нарезает дсРНК на «кубики», содержащие короткие 21-нуклеотидные фрагменты РНК. Затем такие кубики захватываются комплексом белков – RISC (RNA induced silencing complex). В нем дуплекс коротких РНК расплетается, и лишь одна цепь siРНК остается в нем. Далее RISC ведет сканирование молекул РНК клетки, с помощью siРНК-наводчика находит комплементарную последовательность нуклеотидов в соответствующей мРНК и разрезает ее.
Российские ученые планируют создать эффективно работающие генетические конструкции, так называемые кассеты. Они способны кодировать набор siРНК, подавляющих продукцию ВИЧ-1 в клетках человека, несмотря на появление нуклеотидных замен в каких-то отдельных мишенях вируса. Данные об эффективных siРНК позволяют также выбрать их последовательности для химического синтеза олигонуклеотидов ДНК и РНК.
Основным фактором, определяющим эффективность siРНК как эффективного «наводчика», служит правильный выбор мишеней – последовательностей в геноме ВИЧ-1. Для выбора наиболее перспективных мишеней ДНК ВИЧ-1 синтезируются олигонуклеотиды ДНК, соответствующие различным областям вирусного генома, и создаются конструкции, которые обеспечивают экспрессию siРНК в клетках. Затем проводится функциональный анализ активности siРНК-конструкций в первичных векторах, способных экспрессировать РНК-шпильки, из которых в клетках образуются siРНК. Для такого анализа российские специалисты создали тест-систему, позволяющую регистрировать интерференцию, направленную на определенные районы вирусного генома. В Институте молекулярной биологии исследователи применяют безвирусную систему, в которой в качестве репортерного гена используется ген люциферазы из коралла, слитый с выбранным фрагментом генома ВИЧ-1, а также ген люциферазы светлячка. При ко-трансфекции с первичными конструкциями, кодирующими siРНК, эффект РНК-интерференции регистрируется по снижению свечения репортерной коралловой люциферазы. А экспрессия светлячковой люциферазы служит внутренним контролем.
Применяя такую систему, можно провести скрининг различных конструкций и получить количественные данные об эффективности РНК-интерференции. Несомненное достоинство подхода состоит в том, что он не требует работы с вирусом, а предполагает использование лишь разных коротких областей его генома, полученных с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Кассетные конструкции
Для вируса иммунодефицита человека первого типа характерно быстрое возникновение и отбор мутантных вариантов, обладающих резистентностью к различным противовирусным препаратам. Для решения проблемы вирусной изменчивости ученые разработали и создали кассетные конструкции, стабильно экспрессирующие одновременно несколько siРНК. Затем, после оценки экспрессии сложных кассетных конструкций в безвирусной системе, разработчики использовали вирусную модель – культуру клеток человека, инфицированную различными штаммами ВИЧ-1, в частности, штаммами, репродуцирующимися по типу острой и хронической инфекции. Такой подход позволяет проводить исследования, приближенные к реальным процессам развития ВИЧ-инфекции в организме. Применение лабораторных штаммов ВИЧ-1 (в отличие от молекулярных клонов вируса) дает возможность оценивать влияние интерферирующих РНК на естественный пул вирусной популяции, заведомо обладающий генетическим разнообразием. Это также допускает проведение более объективной оценки противовирусной эффективности генетических конструкций.
Эффективность влияния различных конструкций ДНК и РНК оценивается по их способности подавлять репродукцию вируса в культуре клеток человека. Имея большой опыт работы по исследованию влияния различных противовирусных препаратов на репродукцию ВИЧ-1, российские ученые широко используют разработанную ими тест-систему для количественного определения вирусного антигена р24, которая позволяет достоверно оценивать интенсивность развития ВИЧ-инфекции в клетках.
Возможно, в скором будущем уже начнется работа по практическому использованию полученных результатов в генотерапии СПИДа. Достоинство разработанного метода состоит в использование биологических данных об эффективных последовательностях siРНК для экспрессии этих siРНК in vivo, а также для химического синтеза биологически значимых последовательностей в виде модифицированных препаратов РНК. Разработка российских ученых – это новый подход для лечения ВИЧ-инфекции.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
О федеральной целевой научно-технической программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы».
Михаил Алфимов, председатель Российского фонда фундаментальных исследований, aкадемик РАН:
– Есть еще один важный положительный фактор реализации ФЦНТП. Научное сообщество – это самоорганизующаяся структура, она начинает ориентироваться на то, что названо приоритетом. Академическая и вузовская наука имеют другие источники финансирования, но государство дало им сигнал, где требуются знания. На мой взгляд, схема менеджмента Программы выстроена правильно. Так построены системы госзаказа в научно-технической сфере во всех передовых странах.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Татьяна Бархатова, [url=www.sciam.ru/]«В МИРЕ НАУКИ»[/url], № 11-2005
Национальный информационный центр по науке и инновациям Sciencerf.ru
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Последние комментарии
