Генные пушкари
18.10.2005
2722
0
27220
Шифровка из штаба
Представьте себе ленту километровой длины, покрытую вот таким текстом:
תשתאאשתשתאאתשתאמאתתאממאשתשתאמאשמאשתשתאמאאשתאמאשמאשתשתאמממאשת...…
– и даже неизвестно, справа налево его надо читать или наоборот. Если заменить значки на более привычные A, T, G и C (аденин, тимин, гуанин и цитозин), станет понятнее, но ненамного. Следующий шаг – деление текста на слова из трех букв.
В молекуле ДНК 64 возможные трехзначные комбинации из четырех нуклеотидных оснований кодируют 20 аминокислот, из которых состоят все существующие на этой планете белки. Переводчиком в клетке служит матричная рибонуклеиновая кислота – мРНК. Ее алфавит тоже состоит из четырех букв. От языка ДНК он отличается одной буквой: копируя последовательность нуклеотидов, РНК-полимераза заменяет тимин на урацил (U). Кроме того, буквы РНК немного отличаются по «шрифту»: вместо дезоксирибозы в состав ее нуклеотидов входит рибоза.
Буквы генетического кода – нуклеотиды – состоят из остатка фосфорной кислоты, остатка сахара (рибозы или дезоксирибозы) и одного из пяти азотистых оснований. В двойной цепочке ДНК комплементарные (соответствующие) основания удерживаются водородными связями – двумя (A=T) или тремя (G≡C). Сейчас это должен знать каждый школьник, а в 1953 году это узнали Джеймс Уотсон и Френсис Крик – и, за отсутствием большей награды, получили за это Нобелевскую премию. Всего через два десятка лет ученые сумели синтезировать первый ген (Корана, 1972) и ввести чужой ген в бактерию (Коэн и Бойер, 1973). Через четверть века после открытия двойной спирали, в 1978, теория дала практические результаты: бактерии кишечной палочки синтезировали человеческий инсулин. В начале 1980-х в лабораториях появились первые трансгенные мыши, в 1994 был разрешен к продаже первый генетически модифицированный сорт помидоров. А сейчас в мире разрешены к применению сотни штаммов трансгенных микроорганизмов и сотни сортов растений десятков видов. Трансгенных животных пока не выпускают из лабораторий, но генетически модифицированные мыши уже стали обычными лабораторными животными, а трансгенныелососи, свиньи, коровы, козы и прочие звери скоро будут работать живыми фабриками белка, а еще через некоторое время попадут нам на стол.
Переписывание отдельных фраз – генов – из текста ДНК в текст РНК так и называется – транскрипция. А трансляцией на языке молекулярных биологов называется перевод с языка нуклеиновых кислот на язык белков из двух десятков букв, от A или Ala – аланин до V или Val – валин. Аргинин в однобуквенной кодировке обозначается как R, аспарагин – N и так далее, и на всякий случай над столом у тех, кто этим постоянно занимается, висит табличка со шпаргалкой.
Любая рибосома (хотя вместо двух полушарий у нее есть только две белковые глобулы) знает этот алфавит наизусть и, прочитав на цепочке РНК слово «UUG», присоединяет к растущей цепочке белка аминокислоту триптофан, AAG или AAA – лизин, а дойдя до стоп-сигналов – UGA, UAG или UAA – заканчивает синтез. Большинство аминокислот кодируется несколькими кодонами (от двух до шести). Например, команда «присоединяй лейцин» в половине случаев обозначается сочетанием CUG, по 10-20% приходится на CUU, CUC, UUG и UUA, а синоним CUA клетки используют очень редко.
Чертежи и программы
Если команде инженеров и рабочих дать задание построить действующую модель паровоза в натуральную величину, они для начала разберут изделие по винтику и потратят массу бумаги на тома технической документации. Работа живой клетки построена на известном всем программерам принципе открытых исходников – пользуйся, если знаешь, как. Перед тем, как начать перестраивать живые организмы, генные инженеры должны разобраться с текстом программ, записанных в хромосомах.
Самый короткий в мире геном принадлежит вирусоподобной частице с длинным названием «вироид кокосовой пальмы каданг-каданг». (Наверное, название пальмы – это подражание звуку от падения кокосового ореха на другой твердый и круглый предмет.) На языке клетки текст, записанный в этой цепочке РНК длиной 246 нуклеотидов, значит примерно следующее: «копируй_меня_блаблаблаблаблаблабла».
Если записать мелким шрифтом последовательность нуклеотидов в геноме человека (или, например, риса – его геном примерно такого же размера, как у нас с вами), получится том толщиной в миллион страниц, по 3 000 знаков на каждой.
Геном бактерии прочитать относительно просто: единственная бактериальная хромосома содержит в среднем около трех тысяч генов, и вся информация о работе бактерии записана в нескольких миллионах пар нуклеотидов. Геном любого высшего организма – это миллиарды пар нуклеотидов, кодирующих десятки тысяч генов. К тому же в ДНК бактерий очень мало лишней информации, а у эукариотических (имеющих клеточное ядро) организмов, даже у одноклеточных дрожжей, ненужной информации в геноме больше, чем на жестком диске у самого дремучего «чайника». Бессмысленных последовательностей нуклеотидов, псевдогенов (дефектных копий истинных генов), интронов (участков ничего не кодирующей ДНК внутри генов) и другого мусора в нашей ДНК на порядок больше, чем осмысленной информации.
Прочитать геном – это только первый этап работы. После этого надо выделить из полученной последовательности нуклеотидов значащую информацию, понять, какой белок (или какую РНК) кодирует каждый ген (или хотя бы – в каком из генов закодирован нужный нам белок) и как белки взаимодействуют друг с другом. Введенный в хромосому ген может не заработать по множеству причин – например, из-за отсутствия в чужом геноме одного из десятков ферментов, необходимых для всех этапов синтеза конечного белка.
Каждый этап состоит из многих отдельных задач, для выполнения которых нужно произвести много отдельных операций, для каждой из которых необходимо оборудование, от пробирок и чашек Петри до сложных компьютеризированных комплексов, и реактивы – от дистиллированной воды до таких, которые стоят в тысячу раз дороже золота. Когда есть все необходимые материалы, инструменты и знания, можно начинать производство чего-нибудь генетически модифицированного. Например, ввести в хромосому мышиной яйцеклетки ген, выделенный из медузы, и любоваться мышкой, светящейся в темноте зеленым светом.
Инструменты для изготовления инструментов
Вспомните «Таинственный остров» Жюля Верна. Начального капитала у команды инженера Сайруса Смита было всего ничего – линза из часовых стекол да стальная полоска. Потом, правда, появился инвестор – капитан Немо, который подкинул им дополнительные вложения в виде носовых платков, ружей с боеприпасами и других предметов роскоши, а главное – минимум необходимых в хозяйстве инструментов. В результате робинзоны всего за несколько лет прошли путь от каменного века до телеграфа и других передовых достижений тогдашней техники. Но чтобы построить что-нибудь железное, кроме головы и рук, необходимы железная руда и каменный уголь, а также чертежи и инструменты, с помощью которых можно сделать станки, а уже на них – изготовить необходимые для сборки конечного продукта детали.
В биотехнологии каменный век закончился примерно в середине девятнадцатого столетия от Рождества Христова, когда Луи Пастер доказал, что причиной брожения являются дрожжи (он открыл еще много чего, но это – главное). Еще около ста лет в микробиологии, биохимии, генетике, органической химии и других науках происходило накопление критической массы знаний, которое в семидесятых годах ХХ века привело к появлению современной молекулярной и клеточной биологии. Методы изучения и воздействия на живые объекты становились все сложнее и эффективнее, но то, что происходило в лабораториях, долго оставалось чистой наукой – ученые делали чертежи и инструменты. Разница в том, что для перекройки ДНК используют не ножницы и клей, а молекулы ферментов, детали к месту сборки доставляют не вагонетки, а вирусы или потоки заряженных частиц.
Анализ и синтез
А теперь вспомните еще один шедевр – «Парк Юрского периода». Воссоздать динозавров – мечта, скорее всего, неосуществимая. Даже замурованные в янтаре и недоступные для микробов и кислорода, цепочки нуклеотидов постепенно разлагаются, и всего через несколько тысяч лет из образца тканей можно будет добыть только обрывки генов без конца и без начала, и с каждым тысячелетием – все более короткие. Время от времени появляются сообщения о том, что ученым удалось расшифровать последовательность нуклеотидов в ДНК какого-нибудь допотопного зверя (например, летом 2005 – пещерного медведя), но от этих десятков тысяч пар нуклеотидов до Парка Юрского периода – как до Луны пешком. А вот к одному из якутских мамонтов японские ученые примеряются уже давно. В вечной мерзлоте его клетки сохранились достаточно для того, чтобы когда-нибудь в обозримом будущем сложить из фрагментов паззл размером в полный геном, суметь разбить его на хромосомы, заменить ими хромосомы в слоновьей яйцеклетке – и воссоздать вживую давно вымершего исполина. И тогда, вполне возможно, в Якутии будут пастись не только олени…
Если предположить, что гены динозавров смогли сохраниться десятки миллионов лет – ДНК в капельке крови слишком мало для анализа. Но с тех пор, как в 1987 Кэри Муллис изобрел полимеразную цепную реакцию (ПЦР), для изучения ДНК теоретически достаточно одной молекулы.
В учебниках для будущих молекулярных биологов описание ПЦР занимает раза в два больше места, чем вся эта статья – не считая схем на разворот in folio. И это только один (хотя и один из самых важных) методов, которые применяют при анализе и синтезе ДНК.
Что же такое ПЦР? Образец ДНК помещают в пробирку с ферментом ДНК-полимеразой, смесью из всех четырех нуклеотидов и раствором праймеров – синтетических участков из приблизительно 20 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК на концах размножаемого образца (если неизвестно, что там у него на концах, приходится изворачиваться – например, с помощью метода дегенеративных праймеров). Потом раствор нагревают до 90-95° – двойная нить распадается на одиночные, охлаждают до 50° – праймеры присоединяются к комплементарным участкам, и нагревают до 70° – полимераза, используя праймеры, как затравку, достраивает одиночные цепи до двойных. Цикл повторяется, и через 5 минут в растворе будет в 2 раза больше одинаковых двойных цепочек ДНК, через 10 минут – в 4, через 1,5 часа, после двадцати циклов – в миллион, а после тридцати циклов, через 2,5 часа – в миллиард (230) раз больше, чем в исходном растворе.
Давным-давно, почти 20 лет назад, когда ПЦР-анализ только придумали, пробирки с ДНК вручную переставляли из одной водяной бани в другую, а после каждого цикла добавляли в них новую порцию фермента вместо разложившегося при высокой температуре. Но очень скоро просто инженеры придумали для генных инженеров термоциркуляторы, а микробиологи выделили термостойкую ДНК-полимеразу из обитателя горячих источников – микроба Thermus aquaticus. Совсем недавно время процесса удалось сократить, заменив термическое расплетание двойной спирали добавкой фермента хеликазы (от греческого helix – спираль), которая именно этим и занимается в ядре клетки.
Секвенирование – определение последовательности нуклеотидов в ДНК – в середине 1970-х квалифицированный биохимик делал со скоростью несколько сотен нуклеотидов в год. В 2004 в продажу поступил набор Discovery Kids DNA Explorer для научных работников старше 10 лет. Всего за $79.95 любой юный натуралист может за несколько часов сделать анализ, на который ровесники его дедушки тратили несколько лет. А большие дяди и тети, если у них есть полмиллиона долларов, могут купить новейший автоматизированный секвенатор, который расшифровывает 800 000 нуклеотидов в день, и с умилением вспоминать седую древность начала 1990-х, когда примерно столько же делали за год тысячи участников программы «Геном человека».
А один из методов секвенирования ДНК называется «выстрел из дробовика». Но к генным пушкам это не имеет никакого отношения.
Средства доставки
Генные пушки стреляют золотыми пулями размером от 1 до 4 микрон. Их покрывают частицами ДНК, вставляют в гильзы из капелек воды, заряжают в кассету, похожую на обычный холостой патрон, и с помощью сжатого воздуха стреляют в чашку Петри с клетками. Или разгоняют водяные брызги электрическим полем. Такую стрельбу по площадям применяют обычно в случаях, когда клетки не поддаются более точным методам доставки генов в хромосомы – например, для генетической модификации злаков или хвойных деревьев.
Бактерии часто модифицируют с помощью плазмид – характерных для микробов колечек ДНК, на которых хранится несколько генов, несущих информацию, которой нет на основном носителе – хромосоме. Для этого из бактериальной клетки извлекают плазмиды, добавляют в них нужные гены и снова вводят в бактерию.
Являются плазмиды прирученными вирусами или, наоборот, вирусы – одичавшими плазмидами, – такая же неразрешимая загадка, как вопрос о первичности курицы или яйца. Вирусы используют для доставки генов и в плазмиды, и в хромосому бактерий. При делении микробов плазмиды распределяются между дочерними клетками случайным образом, и через несколько поколений потомки модифицированной бактерии могут выродиться в исходную форму или накопить в себе слишком много модифицированных плазмид. А если нужный исследователям ген ввести в ДНК вируса, который заражает не плазмидную, а хромосомную ДНК, трансформация будет более устойчивой.
Обезвреженные ретровирусы с подвешенными к ним генами используют и в генной инженерии животных: если таким вирусом заразить эмбрион, все его клетки при удачном стечении обстоятельств будут нести новый ген. Но грузоподъемность вируса ограничена – не более 8 000 пар нуклеотидов. Кроме того, не исключена возможность серьезных осложнений. Например, при лечении тяжелого комбинированного иммунодефицита – единственной наследственной болезни, которую уже начали лечить с помощью генной терапии – в двух случаях из двенадцати побочным эффектом оказался рак крови. Поэтому при создании трансгенных животных чаще применяют метод микроинъекций ДНК.
Опытный лаборант за день может ввести трансгены в несколько сотен мужских пронуклеусов – так называют ядро сперматозоида перед его слиянием с более мелким ядром яйцеклетки. В лучшем случае из 5% «прооперированных» яйцеклеток рождаются жизнеспособные и несущие нужный ген животные. Их скрещивают между собой, и в соответствии с законами Менделя во втором поколении у каждого четвертого животного в хромосомном наборе оказываются две копии нового гена. После скрещивания таких – гомозиготных – животных третье и все последующие поколения будут полностью трансгенными.
А для создания генетически модифицированных растений самой удобной системой доставки оказались почвенные бактерии – Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes. О том, как и зачем это делают, читайте в следующей статье.
Александр Чубенко
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология», www.cbio.ru
Представьте себе ленту километровой длины, покрытую вот таким текстом:
תשתאאשתשתאאתשתאמאתתאממאשתשתאמאשמאשתשתאמאאשתאמאשמאשתשתאמממאשת...…
– и даже неизвестно, справа налево его надо читать или наоборот. Если заменить значки на более привычные A, T, G и C (аденин, тимин, гуанин и цитозин), станет понятнее, но ненамного. Следующий шаг – деление текста на слова из трех букв.
В молекуле ДНК 64 возможные трехзначные комбинации из четырех нуклеотидных оснований кодируют 20 аминокислот, из которых состоят все существующие на этой планете белки. Переводчиком в клетке служит матричная рибонуклеиновая кислота – мРНК. Ее алфавит тоже состоит из четырех букв. От языка ДНК он отличается одной буквой: копируя последовательность нуклеотидов, РНК-полимераза заменяет тимин на урацил (U). Кроме того, буквы РНК немного отличаются по «шрифту»: вместо дезоксирибозы в состав ее нуклеотидов входит рибоза.
Буквы генетического кода – нуклеотиды – состоят из остатка фосфорной кислоты, остатка сахара (рибозы или дезоксирибозы) и одного из пяти азотистых оснований. В двойной цепочке ДНК комплементарные (соответствующие) основания удерживаются водородными связями – двумя (A=T) или тремя (G≡C). Сейчас это должен знать каждый школьник, а в 1953 году это узнали Джеймс Уотсон и Френсис Крик – и, за отсутствием большей награды, получили за это Нобелевскую премию. Всего через два десятка лет ученые сумели синтезировать первый ген (Корана, 1972) и ввести чужой ген в бактерию (Коэн и Бойер, 1973). Через четверть века после открытия двойной спирали, в 1978, теория дала практические результаты: бактерии кишечной палочки синтезировали человеческий инсулин. В начале 1980-х в лабораториях появились первые трансгенные мыши, в 1994 был разрешен к продаже первый генетически модифицированный сорт помидоров. А сейчас в мире разрешены к применению сотни штаммов трансгенных микроорганизмов и сотни сортов растений десятков видов. Трансгенных животных пока не выпускают из лабораторий, но генетически модифицированные мыши уже стали обычными лабораторными животными, а трансгенныелососи, свиньи, коровы, козы и прочие звери скоро будут работать живыми фабриками белка, а еще через некоторое время попадут нам на стол.
Переписывание отдельных фраз – генов – из текста ДНК в текст РНК так и называется – транскрипция. А трансляцией на языке молекулярных биологов называется перевод с языка нуклеиновых кислот на язык белков из двух десятков букв, от A или Ala – аланин до V или Val – валин. Аргинин в однобуквенной кодировке обозначается как R, аспарагин – N и так далее, и на всякий случай над столом у тех, кто этим постоянно занимается, висит табличка со шпаргалкой.
Любая рибосома (хотя вместо двух полушарий у нее есть только две белковые глобулы) знает этот алфавит наизусть и, прочитав на цепочке РНК слово «UUG», присоединяет к растущей цепочке белка аминокислоту триптофан, AAG или AAA – лизин, а дойдя до стоп-сигналов – UGA, UAG или UAA – заканчивает синтез. Большинство аминокислот кодируется несколькими кодонами (от двух до шести). Например, команда «присоединяй лейцин» в половине случаев обозначается сочетанием CUG, по 10-20% приходится на CUU, CUC, UUG и UUA, а синоним CUA клетки используют очень редко.
Чертежи и программы
Если команде инженеров и рабочих дать задание построить действующую модель паровоза в натуральную величину, они для начала разберут изделие по винтику и потратят массу бумаги на тома технической документации. Работа живой клетки построена на известном всем программерам принципе открытых исходников – пользуйся, если знаешь, как. Перед тем, как начать перестраивать живые организмы, генные инженеры должны разобраться с текстом программ, записанных в хромосомах.
Самый короткий в мире геном принадлежит вирусоподобной частице с длинным названием «вироид кокосовой пальмы каданг-каданг». (Наверное, название пальмы – это подражание звуку от падения кокосового ореха на другой твердый и круглый предмет.) На языке клетки текст, записанный в этой цепочке РНК длиной 246 нуклеотидов, значит примерно следующее: «копируй_меня_блаблаблаблаблаблабла».
Если записать мелким шрифтом последовательность нуклеотидов в геноме человека (или, например, риса – его геном примерно такого же размера, как у нас с вами), получится том толщиной в миллион страниц, по 3 000 знаков на каждой.
Геном бактерии прочитать относительно просто: единственная бактериальная хромосома содержит в среднем около трех тысяч генов, и вся информация о работе бактерии записана в нескольких миллионах пар нуклеотидов. Геном любого высшего организма – это миллиарды пар нуклеотидов, кодирующих десятки тысяч генов. К тому же в ДНК бактерий очень мало лишней информации, а у эукариотических (имеющих клеточное ядро) организмов, даже у одноклеточных дрожжей, ненужной информации в геноме больше, чем на жестком диске у самого дремучего «чайника». Бессмысленных последовательностей нуклеотидов, псевдогенов (дефектных копий истинных генов), интронов (участков ничего не кодирующей ДНК внутри генов) и другого мусора в нашей ДНК на порядок больше, чем осмысленной информации.
Прочитать геном – это только первый этап работы. После этого надо выделить из полученной последовательности нуклеотидов значащую информацию, понять, какой белок (или какую РНК) кодирует каждый ген (или хотя бы – в каком из генов закодирован нужный нам белок) и как белки взаимодействуют друг с другом. Введенный в хромосому ген может не заработать по множеству причин – например, из-за отсутствия в чужом геноме одного из десятков ферментов, необходимых для всех этапов синтеза конечного белка.
Каждый этап состоит из многих отдельных задач, для выполнения которых нужно произвести много отдельных операций, для каждой из которых необходимо оборудование, от пробирок и чашек Петри до сложных компьютеризированных комплексов, и реактивы – от дистиллированной воды до таких, которые стоят в тысячу раз дороже золота. Когда есть все необходимые материалы, инструменты и знания, можно начинать производство чего-нибудь генетически модифицированного. Например, ввести в хромосому мышиной яйцеклетки ген, выделенный из медузы, и любоваться мышкой, светящейся в темноте зеленым светом.
Инструменты для изготовления инструментов
Вспомните «Таинственный остров» Жюля Верна. Начального капитала у команды инженера Сайруса Смита было всего ничего – линза из часовых стекол да стальная полоска. Потом, правда, появился инвестор – капитан Немо, который подкинул им дополнительные вложения в виде носовых платков, ружей с боеприпасами и других предметов роскоши, а главное – минимум необходимых в хозяйстве инструментов. В результате робинзоны всего за несколько лет прошли путь от каменного века до телеграфа и других передовых достижений тогдашней техники. Но чтобы построить что-нибудь железное, кроме головы и рук, необходимы железная руда и каменный уголь, а также чертежи и инструменты, с помощью которых можно сделать станки, а уже на них – изготовить необходимые для сборки конечного продукта детали.
В биотехнологии каменный век закончился примерно в середине девятнадцатого столетия от Рождества Христова, когда Луи Пастер доказал, что причиной брожения являются дрожжи (он открыл еще много чего, но это – главное). Еще около ста лет в микробиологии, биохимии, генетике, органической химии и других науках происходило накопление критической массы знаний, которое в семидесятых годах ХХ века привело к появлению современной молекулярной и клеточной биологии. Методы изучения и воздействия на живые объекты становились все сложнее и эффективнее, но то, что происходило в лабораториях, долго оставалось чистой наукой – ученые делали чертежи и инструменты. Разница в том, что для перекройки ДНК используют не ножницы и клей, а молекулы ферментов, детали к месту сборки доставляют не вагонетки, а вирусы или потоки заряженных частиц.
Анализ и синтез
А теперь вспомните еще один шедевр – «Парк Юрского периода». Воссоздать динозавров – мечта, скорее всего, неосуществимая. Даже замурованные в янтаре и недоступные для микробов и кислорода, цепочки нуклеотидов постепенно разлагаются, и всего через несколько тысяч лет из образца тканей можно будет добыть только обрывки генов без конца и без начала, и с каждым тысячелетием – все более короткие. Время от времени появляются сообщения о том, что ученым удалось расшифровать последовательность нуклеотидов в ДНК какого-нибудь допотопного зверя (например, летом 2005 – пещерного медведя), но от этих десятков тысяч пар нуклеотидов до Парка Юрского периода – как до Луны пешком. А вот к одному из якутских мамонтов японские ученые примеряются уже давно. В вечной мерзлоте его клетки сохранились достаточно для того, чтобы когда-нибудь в обозримом будущем сложить из фрагментов паззл размером в полный геном, суметь разбить его на хромосомы, заменить ими хромосомы в слоновьей яйцеклетке – и воссоздать вживую давно вымершего исполина. И тогда, вполне возможно, в Якутии будут пастись не только олени…
Если предположить, что гены динозавров смогли сохраниться десятки миллионов лет – ДНК в капельке крови слишком мало для анализа. Но с тех пор, как в 1987 Кэри Муллис изобрел полимеразную цепную реакцию (ПЦР), для изучения ДНК теоретически достаточно одной молекулы.
В учебниках для будущих молекулярных биологов описание ПЦР занимает раза в два больше места, чем вся эта статья – не считая схем на разворот in folio. И это только один (хотя и один из самых важных) методов, которые применяют при анализе и синтезе ДНК.
Что же такое ПЦР? Образец ДНК помещают в пробирку с ферментом ДНК-полимеразой, смесью из всех четырех нуклеотидов и раствором праймеров – синтетических участков из приблизительно 20 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК на концах размножаемого образца (если неизвестно, что там у него на концах, приходится изворачиваться – например, с помощью метода дегенеративных праймеров). Потом раствор нагревают до 90-95° – двойная нить распадается на одиночные, охлаждают до 50° – праймеры присоединяются к комплементарным участкам, и нагревают до 70° – полимераза, используя праймеры, как затравку, достраивает одиночные цепи до двойных. Цикл повторяется, и через 5 минут в растворе будет в 2 раза больше одинаковых двойных цепочек ДНК, через 10 минут – в 4, через 1,5 часа, после двадцати циклов – в миллион, а после тридцати циклов, через 2,5 часа – в миллиард (230) раз больше, чем в исходном растворе.
Давным-давно, почти 20 лет назад, когда ПЦР-анализ только придумали, пробирки с ДНК вручную переставляли из одной водяной бани в другую, а после каждого цикла добавляли в них новую порцию фермента вместо разложившегося при высокой температуре. Но очень скоро просто инженеры придумали для генных инженеров термоциркуляторы, а микробиологи выделили термостойкую ДНК-полимеразу из обитателя горячих источников – микроба Thermus aquaticus. Совсем недавно время процесса удалось сократить, заменив термическое расплетание двойной спирали добавкой фермента хеликазы (от греческого helix – спираль), которая именно этим и занимается в ядре клетки.
Секвенирование – определение последовательности нуклеотидов в ДНК – в середине 1970-х квалифицированный биохимик делал со скоростью несколько сотен нуклеотидов в год. В 2004 в продажу поступил набор Discovery Kids DNA Explorer для научных работников старше 10 лет. Всего за $79.95 любой юный натуралист может за несколько часов сделать анализ, на который ровесники его дедушки тратили несколько лет. А большие дяди и тети, если у них есть полмиллиона долларов, могут купить новейший автоматизированный секвенатор, который расшифровывает 800 000 нуклеотидов в день, и с умилением вспоминать седую древность начала 1990-х, когда примерно столько же делали за год тысячи участников программы «Геном человека».
А один из методов секвенирования ДНК называется «выстрел из дробовика». Но к генным пушкам это не имеет никакого отношения.
Средства доставки
Генные пушки стреляют золотыми пулями размером от 1 до 4 микрон. Их покрывают частицами ДНК, вставляют в гильзы из капелек воды, заряжают в кассету, похожую на обычный холостой патрон, и с помощью сжатого воздуха стреляют в чашку Петри с клетками. Или разгоняют водяные брызги электрическим полем. Такую стрельбу по площадям применяют обычно в случаях, когда клетки не поддаются более точным методам доставки генов в хромосомы – например, для генетической модификации злаков или хвойных деревьев.
Бактерии часто модифицируют с помощью плазмид – характерных для микробов колечек ДНК, на которых хранится несколько генов, несущих информацию, которой нет на основном носителе – хромосоме. Для этого из бактериальной клетки извлекают плазмиды, добавляют в них нужные гены и снова вводят в бактерию.
Являются плазмиды прирученными вирусами или, наоборот, вирусы – одичавшими плазмидами, – такая же неразрешимая загадка, как вопрос о первичности курицы или яйца. Вирусы используют для доставки генов и в плазмиды, и в хромосому бактерий. При делении микробов плазмиды распределяются между дочерними клетками случайным образом, и через несколько поколений потомки модифицированной бактерии могут выродиться в исходную форму или накопить в себе слишком много модифицированных плазмид. А если нужный исследователям ген ввести в ДНК вируса, который заражает не плазмидную, а хромосомную ДНК, трансформация будет более устойчивой.
Обезвреженные ретровирусы с подвешенными к ним генами используют и в генной инженерии животных: если таким вирусом заразить эмбрион, все его клетки при удачном стечении обстоятельств будут нести новый ген. Но грузоподъемность вируса ограничена – не более 8 000 пар нуклеотидов. Кроме того, не исключена возможность серьезных осложнений. Например, при лечении тяжелого комбинированного иммунодефицита – единственной наследственной болезни, которую уже начали лечить с помощью генной терапии – в двух случаях из двенадцати побочным эффектом оказался рак крови. Поэтому при создании трансгенных животных чаще применяют метод микроинъекций ДНК.
Опытный лаборант за день может ввести трансгены в несколько сотен мужских пронуклеусов – так называют ядро сперматозоида перед его слиянием с более мелким ядром яйцеклетки. В лучшем случае из 5% «прооперированных» яйцеклеток рождаются жизнеспособные и несущие нужный ген животные. Их скрещивают между собой, и в соответствии с законами Менделя во втором поколении у каждого четвертого животного в хромосомном наборе оказываются две копии нового гена. После скрещивания таких – гомозиготных – животных третье и все последующие поколения будут полностью трансгенными.
А для создания генетически модифицированных растений самой удобной системой доставки оказались почвенные бактерии – Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes. О том, как и зачем это делают, читайте в следующей статье.
Александр Чубенко
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология», www.cbio.ru
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Последние комментарии
