Искусственные белки паутины для медицины

Ловчая сеть паука построена из нескольких белков. Ученых больше всего интересует каркасная нить паутины, необычайно прочная (нити на разрыв в несколько раз прочнее стали) и эластичная. Каркасная нить паутины состоит из двух белков: более прочного спидроина-1 и более эластичного спидроина-2. Именно сочетание их свойств определяет уникальные свойства паутины. Такой материал может найти применение в первую очередь в медицине в качестве шовного материала, искусственных связок и сухожилий, пленок для заживления ран, ожогов и пр.

Синтезировать эти белки в лаборатории химическим путем невозможно - они слишком сложны. Но их можно получить биотехнологическим способом, синтезировав соответствующий ген и заставив его работать в составе некоего микроорганизма. На первом этапе исследователи сосредоточились на получении спидроина-1. Проблема в том, что структура этого белка не полностью расшифрована, и в международной базе данных есть только фрагменты, а полной аминокислотной последовательности нет. Поэтому ученые решили попробовать использовать известный фрагмент для синтеза гена и получения рекомбинантного белка.

Исследователям удалось синтезировать ген, кодирующий фрагмент спидроина-1 размером 3600 пар нуклеотидов. Ген в составе плазмиды перевели в клетки дрожжей Pichia pastoris, специальный штамм которых благодаря особой мутации идеально подходит для биотехнологических манипуляций, и убедились в том, что внутри дрожжевой клетки он работает - дрожжи продуцируют белок. Наличие искомого белка в отобранных дрожжевых клетках проверяют методом электрофореза (на геле появляется полоска белка, положение которой соответствует его молекулярной массе) и последующего иммуноблоттинга (полоски белка переносят на специальную мембрану и выявляют с помощью специфических антител).

Дрожжи растут и нарабатывают белок в специальном аппарате - ферментере. Через несколько суток суспензию клеток с готовым продуктом частично сливают, доливают свежую культуральную среду, и цикл повторяется. Поэтому процесс называют квазинепрерывным.

Ученые разработали оригинальную методику выделения и очистки рекомбинантных белков и с ее помощью получили сотни мг продукта. Однако получить обычными способами белковый раствор 40%-ной концентрации (400 мг в одном мл) задача не простая. Для растворения белка использовали соль роданид натрия, и таким образом получили так называемый прядильный раствор, из которого надо было спрясть нитку, как это делает паук.


Фотография искусственной нити, полученной на основе выделенного из клеток дрожжей рекомбинантного белка - аналога белка каркасной нити паутины паука Nephila clavipes (в сосуде с этанолом).

На этом этапе ученые разработали процесс искусственного прядения и научились получать эластичную нить, которую проверили на прочность специалисты Научно-иследовательского центра "Углехимволокно" в Мытищах. Нить толщиной всего в несколько микрон выдерживает на разрыв 50-100 мг груза. Она оказалась всего лишь в четыре раза менее прочной, чем у паука, а это очень хороший результат. В то же время величина значения энергии разрыва (упругость) у этой нити уже выше, чем у кости или сухожилия.

Из белка можно делать не только нити, но и пленки. Именно в таком виде его предполагают использовать для изготовления заживляющих покрытий для ран и ожогов, которые не будут отторгаться организмом и будут стимулировать регенерацию собственного эпителия. Пока пленки, изготовленные из рекомбинантного белка, исследовали в экспериментах на культуре клеток на предмет токсичности. Вывод ученых - пленки нетоксичны.

Параллельно проводится работа по получению рекомбинантного спидроина-2. Структура большей части этого белка известна, но чрезвычайно сложна. Прежде, чем синтезировать ген спидроина-2, надо было тщательно исследовать последовательность аминокислот в молекуле. За дело взялись математики, которые выявили и проанализировали в цепочке периодически повторяющиеся последовательности. Благодаря этому, молекулу оказалось возможным разделить на блоки-мономеры и сначала синтезировать отдельные блоки, а затем соединять их в определенной последовательности. "Таким путем мы собираем ген, - рассказывает руководитель проекта ведущий научный сотрудник Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов Владимир Григорьевич Богуш. - Это очень длительная работа, и она еще не закончена. Но наша конечная цель - получить максимально полный аналог природного гена спидроина-2".

Пока идет работа над сложным геном спидроина-2, ученые синтезировали ген, соответствующий одному из его фрагментов (так же, как они работали со спидроином-1). Созданный ген встроили в клетки дрожжей и получили белок - аналог спидроина-2.

Когда ученым удастся довести до конца синтез сложнейшего гена и получить полный природный аналог спидроина-2, можно будет, смешивая два белка в разных соотношениях и меняя свойства искусственной нити паутины в ту или иную сторону, довести ее до совершенства.

Татьяна Черний, http://www.sciam.ru/