Каждому – по геному!
25.04.2006
7248
0
72480
Джордж Черч
В ближайшее десятилетие мы станем свидетелями появления новых технологий, которые превратят секвенирование ДНК в недорогую рутинную процедуру. Грядет эра персонифицированной медицины, и готовиться к ней нужно уже сегодня.
Когда в 1993 г. появился Интернет, многим показалось, что это произошло в одночасье, совсем не так, как пробивало себе дорогу в жизнь большинство новых технологий, когда с момента зарождения идеи до ее реализации проходили годы, а то и десятилетия. Однако Всемирная паутина возникла не на пустом месте. Должна была сложиться необходимая инфраструктура, в частности, появиться Интернет (1965-1995 гг.) и огромное число персональных компьютеров – некая «критическая масса», которая и привела к запуску компьютерной «цепной реакции».
Движущая сила любой инновации – способность улавливать появление спроса на ту или иную продукцию. Так, космическая программа, зародившаяся некогда в правительственных и научных кругах, уже содержала в себе ростки того технологического прорыва, который привел к широкому использованию искусственных спутников Земли в военных, промышленных и коммерческих целях. То же самое происходит сейчас в биотехнологии. Мы можем лишь предполагать, какие потребности общества, открытия и изобретения будут предшествовать ее триумфальному выходу на сцену и когда возникнут необходимые для этого инфраструктурные предпосылки.
В 1984–1985 гг. я был одним из тех, кто ратовал за реализацию проекта «Геном человека». Его первоочередной задачей было побуквенное «прочтение» всей генетической информации, записанной в геномной ДНК человека. Предполагалось, что работа займет около 15 лет, будет стоить $3 млрд. и завершится к 2005 г.
Нам удалось секвенировать 93% генома несколькими годами раньше запланированного срока, попутно был разработан целый ряд новых биологических методов. Их последующее усовершенствование позволило снизить стоимость процесса до $20 млн. при достаточно высокой точности. Правда, это предполагает проведение всей процедуры в одном из специализированных центров, занимающихся реализацией крупных научных проектов.
Когда стоимость секвенирования генома человека удастся снизить до $1 тыс., можно будет подумать о том, чтобы каждый из нас имел при себе такую бесценную «визитную карточку», как нуклеотидная последовательность всей его геномной ДНК. Она окажет неоценимую услугу при медицинском обследовании, выборе лекарственных препаратов, выявлении предрасположенности к тем или иным заболеваниям и т.д. Доступная цена позволит проводить сравнительный анализ геномов, который даст возможность понять различия между нами и установить первопричины многих болезней.
«Человеческая» геномика выходит далеко за рамки генома самого человека и включает исследование генетического материала разнообразных патогенных и полезных микроорганизмов, присутствующих в окружающей среде, пищевых продуктах и нашем организме. Возможно, когда-нибудь в повседневную жизнь войдут ежедневно обновляемые генетические карты этих агентов, на которые мы сможем ориентироваться точно так же, как, скажем, на сводки погоды. Бурное развитие нанотехнологий и промышленной биотехнологии подготовят почву для создания искусственных микроорганизмов, которые будут вырабатывать полезные вещества с необычными свойствами или выполнять функции мусорщиков, наводящих порядок в окружающей среде.
Стоимость подобных проектов, в том числе тех, о которых мы сегодня даже и не подозреваем, очень высока. Поэтому пока разработчики программы «Революционные методы секвенирования генома», финансируемой Национальными институтами здравоохранения США, ориентируют ее участников на то, чтобы снизить стоимость секвенирования генома человека до $100 тыс. к 2009 г. и до $1 тыс. к 2014 г. Первую группу ученых, которым удастся решить задачу, ждет солидное денежное вознаграждение. И, похоже, цель уже близка. Есть основания полагать, что менее чем через четыре года подобная процедура будет стоить около $20 тыс.
• Потенциал биотехнологии будет реализован в полной мере только тогда, когда ее инструментарий (например, секвенирование геномов) станет столь же доступным и недорогим, как персональные компьютеры.
• Чтобы снизить стоимость процедуры секвенирования, разработчики новых методов стараются сократить число подготовительных этапов, до предела миниатюризировать оборудование и проводить секвенирование миллионов молекул одновременно.
• Как только цель будет достигнута, на повестку дня встанет вопрос о том, в каком объеме и кто сможет иметь доступ к информации о личных генетических данных. Одной из задач проекта «Персональный геном» является разрешение подобных этико-социальных проблем.
ДНК клетки, приступающая к делению, претерпевает кардинальные изменения: двойная спираль раскручивается, цепи расходятся. На каждой из них начинается синтез комплементарных полинуклеотидов, на одной – непрерывный, на второй прерывистый. Его катализирует фермент под названием полимераза; другой фермент, лигаза, сшивает полинуклеотидные фрагменты в непрерывную цепь. Так из одной молекулы ДНК образуются две.
Многие методы секвенирования ДНК основаны на взаимной комплементарности цепей этой молекулы. Генетический алфавит состоит всего из четырех букв – азотистых оснований аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т). Основания противоположных цепей молекулы ДНК соединяются в соответствии с правилом комплементарности: А образует пару с Т, а С – с G. В результате такого взаимодействия образуется хорошо известная двойная спираль – структура, напоминающая винтовую лестницу. Живые организмы используют принцип комплементарности при копировании своего генетического материала и устранения повреждений в нем (репарации) (см. внизу). Он же лежит в основе амплификации целевых фрагментов ДНК и их последующего секвенирования с помощью метода, разработанного в конце 1970-х гг. Ф. Сангером (пп. 1-2).
1. Перед секвенированием по методу Сангера молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2. ПЦР состоит в следующем. Образец ДНК нагревают до температуры, при которой происходит расхождение цепей. Затем в реакционную смесь добавляют дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и праймер – короткий олигонуклеотид, комплементарный небольшому сегменту ДНК-матрицы. Он гибридизуется с этим сегментом, и ДНК-полимераза последовательно присоединяет к его концу dNTP, комплементарные нуклеотидам копируемой цепи. Процесс многократно повторяют, пока не получат миллионы копий каждого фрагмента.
3. Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырем пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.
4. Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определенной длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.
Геном человека состоит из трех миллиардов пар нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит одно из четырех азотистых оснований – А, С, G или Т, составляющих тот алфавит, с помощью которого записывается генетическая информация в молекуле ДНК. Основания одной цепи ДНК спариваются с основаниями другой цепи по строго определенным правилам (А образует пару с Т, G – с С), поэтому достаточно определить последовательность оснований в одной из них.
Чтобы идентифицировать конкретное основание в какой-то области генома, необходим сенсор, способный заметить субнанометровое различие между А, Т, G и С. Единственный физический метод, обладающий столь высокой разрешающей способностью, – сканирующая туннельная спектроскопия. Однако при секвенировании последовательностей длиной в миллиарды звеньев чаще всего используются не физические, а химические способы.Геном человека был расшифрован с помощью методики, разработанной в конце 1970-х гг. американским биохимиком Фредериком Сангером. При этом процедуре секвенирования предшествует разрезание исследуемой молекулы ДНК на фрагменты, клонирование их в E. сoli и многократная дупликация для получения миллионов копий каждого фрагмента. В результате последнего раунда дупликации, проводимого в особых условиях, получают набор копий фрагментов разной длины, каждый из которых заканчивается флуоресцентно меченым нуклеотидом. Фрагменты разделяют по длине с помощью электрофореза, регистрируют световой сигнал от каждого из них по мере прохождения через детектор и получают нуклеотидную последовательность исходной цепи.
К достоинствам метода Сангера относятся его относительная простота и высокая точность, но, несмотря на последующие усовершенствования, он остается дорогим и трудоемким. Задача создателей альтернативных путей секвенирования состояла в повышении скорости процедуры и ее удешевлении. Для этого нужно было исключить этапы разделения, занимающие много времени, миниатюризировать всю систему, сохранив при этом возможность прочитывать последовательности миллионов фрагментов.
Многие исследовательские группы положили в основу своих разработок биосинтез – процесс, который используют живые организмы при воспроизведении своего генома и устранении в нем повреждений. Так, в клетке, готовящейся к делению, двойная спираль ДНК расплетается, составляющие ее цепи расходятся, а затем на каждой из них синтезируется новая цепь (на одной – непрерывно, на другой – прерывисто, с образованием отдельных фрагментов). Процесс последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи катализируется особым ферментом ДНК-полимеразой. Другой фермент, лигаза, сшивает фрагменты. В результате образуются две новые полноразмерные полинуклеотидные цепи, комплементарные тем ДНК-матрицам, на которых они синтезировались.
Методы секвенирования при помощи биосинтеза берут за основу те стадии упомянутого процесса, которые протекают на одиночной цепи секвенируемой ДНК. Регистрируется момент присоединения к праймеру, гибридизовавшемуся с ДНК-матрицей, комплементарного нуклеотида (удлинение цепи), или момент сшивания лигазой праймера с олигонуклеотидным зондом, содержащего известный нуклеотид в определенной позиции.
Существуют разные способы регистрации данных процессов, но обычно используется один из двух типов сигналов. Если меткой служит присоединенный к нуклеотиду флуорофор, то регистрируется испускаемый им свет определенной длины волны. Флуоресцентное детектирование применяют при секвенировании как методом удлинения цепи, так и методом лигирования. Его используют многие исследователи, среди которых – Майкл Мецкер (Michael Metzker) из Университета Бэйлора, Роби Митра (Robi Mitra) из Вашингтонского университета, а также возглавляемая мною лаборатория в Гарвардской медицинской школе и в корпорации Agencourt Bioscience.
Другой подход основан на регистрации биолюминесценции, которая инициируется связыванием с белком люциферазой (его синтезируют хорошо знакомые нам светлячки) пирофосфата, высвобождаемого после присоединения к праймеру очередного нуклеотида. Он создан Мустафой Ронаги (Mostafa Ronaghi) из Стэнфордского университета и применяется фирмами Pyrosequencing/Biotage и 454 Life Sciences.
В обоих случаях для получения достаточно сильного сигнала приходится проводить одновременно большое число реакций комплементарного спаривания и тестировать сразу множество копий целевой последовательности. Правда, предпринимаются попытки создать метод детектирования, позволяющий улавливать сигнал от одной молекулы. Над этим работают Стивен Квейк (Stephen Quake) из Калифорнийского технологического института и фирмы Helicos Biosciences и Nanofluidics. Если их усилия увенчаются успехом, то существенно сократится и стоимость процедуры секвенирования, и время ее проведения.
При детектировании флуоресценции одной молекулы 5% сигналов не улавливается, и, чтобы ликвидировать возникающие в результате пробелы в последовательности, приходится проводить считывание несколько раз. По этой причине многие предпочитают вначале амплифицировать секвенируемую цепь ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Здесь тоже разработан целый ряд новых подходов, позволяющих обойтись без предварительного клонирования ДНК в бактериальных клетках.
Один из них – бесклеточная система амплификации, созданная Эриком Кавасимой (Eric Kawashima) из Института фармакологических исследований Сероно в Женеве, Александром Четвериным из Института белка РАН в г. Пущино и Роби Митрой из Гарвардского университета. Метод состоит в создании с помощью ПЦР отдельных молекулярных колоний (миллионов копий одной-единственной молекулы ДНК) прямо на предметном стекле микроскопа или на пластинке геля. Каждая такая колония (в англоязычной литературе ее называют polony, от PCR-colony) не превышает в диаметре одного микрона, и на одной подложке их помещается до нескольких миллиардов.
Молекулярные колонии можно выращивать также на крошечных бусинках, заключенных в масляной капле – своеобразной камере для проведения ПЦР. Миллионы таких бусин, покрытых копиями ДНК-матриц, фиксируют на гелевой пластине и проводят одновременное секвенирование всех молекул.
Список методов амплификации матриц, их секвенирования и регистрации сигнала велик. Так, в основе одного из альтернативных методов лежит способность цепей ДНК спариваться (гибридизоваться) лишь с комплементарными последовательностями. Способ, впервые примененный компаниями Affymetrix, Perlegen Sciences и Illumina, получил широкое распространение. Его используют прежде всего для выявления минимальных различий в нуклеотидных последовательностях уже идентифицированных генов. Для этого синтезируют короткие одноцепочечные ДНК со всеми мыслимыми последовательностями и фиксируют их на большой подложке. Затем с ними инкубируют копии матрицы, которую хотят секвенировать, и регистрируют интенсивность флуоресценции. Чем точнее соответствие между матрицей и фиксированной на подложке последовательностью, тем сильнее флуоресцения. В такой тест на специфичность гибридизации иногда включают дополнительную стадию – удлинение цепи.
Один из наиболее перспективных методов секвенирования использует для идентификации оснований в молекуле ДНК совсем другой принцип – физическое различие между четырьмя нуклеотидами, А, Т, G и С. Одноцепочечную ДНК протягивают через пору диаметром 1,5 нм, пронизывающую мембрану, и регистрируют изменение электропроводности последней по мере поочередного прохождения нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение электропроводности, что и позволяет прочитать нуклеотидную последовательность цепи. Метод разработан Дэном Брэнтоном (Dan Branton) из Гарварда, Дейвом Димером (Dave Deamer) из Калифорнийского университета (г. Санта-Крус) и автором этой статьи Джорджем Черчем (George M. Church) и апробируется сейчас компанией Agilent Technologics.
Альтернативный метод детектирования использует не флуоресценцию нуклеотида, а биолюминесценцию белка, возбуждаемую присоединением к нему пирофосфата, который отщепляется от dNTP в момент его включения в растущую цепь.
Следующие два метода секвенирования (удлинение цепи и лигирование) основываются на многократном повторении определенных биохимических реакций (внизу). Чтобы ускорить процесс и снизить его стоимость, ученые стремятся уменьшить их число, миниатюризировать систему и проводить секвенирование миллионов фрагментов ДНК одновременно
Одноцепочечный фрагмент ДНК, называемый матрицей, вместе с коротким олигонуклеотидом, комплементарным ее концевому участку, фиксируют на подложке (а). Добавляют флуоресцентно меченные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и полимеразу, которая присоединяет к концу праймера dNTP, комплементарный соответствующему звену матрицы (б). Несвязавшиеся dNTP и полимеразу удаляют с помощью лазера, возбуждают флуоресценцию присоединенного к праймеру нуклеотида и идентифицируют его (в). Удаляют флуорофор и продолжают удлинение цепи.
К одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать (а). Синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырех нуклеотидов – А, Т, G или С (б). После того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером (в). Этот момент фиксируют, идентифицируют зонд, удаляют с матрицы комплекс и повторяют всю процедуру.
Световой сигнал от одной молекулы, сигнализирующий о моменте присоединения к праймеру очередного нуклеотида или сшивании праймера с зондом, очень слабый. Чтобы усилить его, удлинение цепи или лигирование проводят одновременно на миллионах копий одной матрицы. Копии получают в бесклеточной системе одним из двух способов (а и б), используя в обоих случаях ПЦР.
а) Молекулярные колонии образуются прямо на стеклянной пластинке или на пластине геля. Они состоят из миллионов копий одной и той же матрицы.
б) Масляная капля с включенной в нее полимеразой служит миниатюрной реакционной камерой. Матрица, фиксированная на стеклянной бусинке, проникает внутрь капли, и на ней образуется до 10 миллионов копий
Чтобы максимально ускорить процесс, секвенируют одновременно тысячи и даже миллионы разных фрагментов матрицы. Для этого их фиксируют на одной подложке и проводят реакцию удлинения цепи с регистрацией флуоресценции.
Альтернативный подход состоит в иммобилизации бусинок с миллионами копий матрицы и одновременном их секвенировании методом лигирования. Здесь показан микроскопический участок (0,01%) стеклянной подложки, покрытой светящимися молекулярными колониями.
Интересно было сравнить новые системы секвенирования ДНК друг с другом и с методом Сангера, что недавно и попытались сделать две исследовательские группы – одна из компании 454 Life Sciences, вторая из Гарвардской медицинской школы.
Мои коллеги и я описали систему секвенирования методом лигирования, в которой используется амплификация ДНК-матрицы на бусинках (диаметром один микрон) и обычный цифровой микроскоп для идентификации импульсов флуоресценции. Ученые из 454 Life Sciences амплифицировали ДНК-матрицу таким же способом (диаметр бусинок составлял 28 микрон), но секвенирование проводили методом удлинения цепи и детектировали биолюминесценцию белка после связывания с ним пирофосфата. Объектом секвенирования в обоих случаях была последовательность длиной 30 млн. нуклеотидов. Скорость процесса составляла 400 и 1,7 тыс. звеньев в секунду для первой и второй систем соответственно. Чтобы повысить точность, секвенирование обычно многократно повторяют. При 43 повторах, произведенных группой 454 Life Sciences, точность составила одну ошибку на 2,5 тыс. звеньев, а наша группа совершила 7-кратное секвенирование с точностью одна ошибка на 3 млн.
Минимальная цена секвенирования с использованием гель-электрофореза составляет $1 за 150 п.н. Во что обошлась работа группе 454 Life Sciences – не сообщается, а мы за $1 расшифровали последовательность длиной 1,4 тыс. п.н., т.е. наш метод оказался экономичнее примерно в девять раз.
Есть основания полагать, что очень скоро цена секвенирования геномной ДНК человека снизится до $100 тыс. Теперь, когда сам процесс уже автоматизирован, удешевить его можно за счет уменьшения количества реагентов и снижения стоимости оборудования. Благодаря миниатюризации системы количество реагентов уже стало в миллиард раз меньше: если в методе Сангера реакционный объем составлял несколько микролитров, то сегодня – несколько фемтолитров.
Многие современные системы анализа изображений считывают данные со скоростью один миллиард байт в минуту, а компьютеры обрабатывают информацию со скоростью несколько миллионов операций в секунду. Чтобы использовать их возможности в полной мере, нужно существенно уменьшить характерное время физических и химических процессов, вовлеченных в секвенирование (таких как электрофорез или ферментативные реакции), что нереально, или же сделать всю систему более компактной как в пространстве, так и во времени.
Сравнивая новые и старые пути секвенирования, следует учитывать еще один момент. Современные способы чаще всего считывают последовательности короткими сегментами длиной от 5 до 400 п.н., а для метода Сангера их величина обычно составляет 800 п.н. Таким образом, расшифровка неизвестных геномов, включающая их «склеивание» из обрывков, для новых методов представляется более трудной задачей. Впрочем, если основной целью секвенирования станет выявление минимальных вариаций в ДНК в медицинских целях, то небольшая длина прочитываемых фрагментов не породит новых проблем.
Требования к точности секвенирования зависят от того, в каких целях оно проводится. Если речь идет о диагностике, то нынешняя ошибка в 0,01%, с которой расшифрован геном человека, слишком велика, поскольку она означает, что 600 тыс. позиций в нем ошибочны. С другой стороны, для классификации различных РНК и тканей приемлемой считается ошибка в 4%, типичная для анализа генома методом случайной выборки.
Отрицательно заряженная одноцепочечная ДНК проходит через нанометровую пору в мембране, наружная поверхность которой несет отрицательный заряд, а внутренняя – положительный (а). Как только очередной нуклеотид перекрывает внутреннее отверстие в поре, электропроводность мембраны (измеряемая здесь в пикоамперах) изменяется. Нуклеотиды разного типа, из которых состоит цепочка ДНК, немного различаются по размерам и поэтому закрывают пору в большей или меньшей степени и на разное время (б). Соответственно этому изменяется и электропроводность (в). Если удастся существенно повысить разрешающую способность метода, то каждый скачок электропроводности будет отвечать прохождению через пору одного нуклеотида, и с диаграммы, получаемой на выходе, можно будет считывать нуклеотидные последовательности (г). Секвенирование генома человека займет в этом случае всего 20 часов, поскольку многократной амплификации матрицы не понадобится.
[lib]pogenomu10.jpg [/lib]
[lib]pogenomu11.gif [/lib]
Помимо разработки новых методов секвенирования, нужно обеспечить возможность их незамедлительного применения. Необходимы компьютерные программы, способные обрабатывать информацию таким образом, чтобы она была понятна пользователям, например врачам. Возможно, возникнет потребность в составлении для каждого пациента индивидуального перечня наиболее значимых генетических вариаций. Не менее важно предусмотреть все последствия широкого распространения новых технологий для человеческого сообщества.
Еще на первых этапах реализации проекта «Геном человека» было принято решение о выделении ежегодно $10 млн. на анализ возникающих по ходу дела этических и социальных проблем. Участники проекта договорились, что вся информация должна быть обнародована не позднее чем через неделю с момента ее получения, при этом следует пресекать все попытки ее коммерциализации. Предметом особой заботы стало сохранение анонимности персональных данных, на основании которых была построена карта генома «усредненного человека», опубликованная в печати. Но многие серьезные вопросы так и остались без ответа. Главный из них – как предотвратить несанкционированное использование личной геномной информации человека учеными, медиками, страховыми агентствами, работодателями, органами юстиции, директорами школ и высших учебных заведений, правительственными организациями и т.д.
Осознавая важность данных проблем и трудность их разрешения, я и мои коллеги выступили с инициативой разработки проекта «Персональный геном», который предусматривает проведение детального анализа всех последствий открытости генетических данных.
Мы помним, как изменилась экономика, наука и вся наша жизнь с появлением персональных компьютеров. Не менее масштабные перемены ожидают нас после того, как расшифровка генома человека станет обычным делом, и мы должны быть готовы к этому.
Джордж Черч, сфотографированный на фоне переливающихся всеми цветами радуги молекулярных колоний, будет одним из первых, кто предоставит данные о своем геноме всем желающим.
Уже многие годы каждый новорожденный перед выпиской из родильного дома проходит тест на фенилкетонурию, одно из наследственных заболеваний. Сегодня многих больных раком легких определенной формы проверяют на наличие в их геноме вариантных форм гена EGFR, чтобы оценить целесообразность проведения химиотерапии с применением препарата Iressa. К генетическим тестам все чаще прибегают для того, чтобы подобрать больному дозу необходимого лекарства с учетом особенностей его метаболизма. Все свидетельствует о том, что мы стоим на пороге появления персонифицированной медицины, дело лишь за тем, как скоро удастся снизить стоимость процедуры секвенирования генома человека.
Персональный геном содержит информацию, интересную не только с медицинской, но и с генеалогической точки зрения. С его помощью можно узнать, каковы наши корни, связаны ли мы родственными узами с теми или иными людьми. Тысячи или даже миллионы наборов данных, заключенных в полной нуклеотидной последовательности геномной ДНК, помогут ответить, например, на такой вопрос: «Какие генетические особенности и взаимодействия между генами и окружающей средой формируют наш внешний облик или отвечают за те или иные черты характера?»
Доступ к информации о генетическом статусе человека открывает невиданные возможности, но тут же встает вопрос о правомочности ее использования страховыми агентами, работодателями, политиками и т.д.
Пройдет немало времени, прежде чем мы ощутим, насколько изменилась наша жизнь с наступлением эры персонифицированной геномики. Чтобы заглянуть в будущее, я и мои коллеги недавно приступили к реализации идеи «Персональный геном», который мы рассматриваем как логическое продолжение проекта «Геном человека». Мы намереваемся оценить возможные опасности и риски персональной геномики и собираемся привлечь добровольцев, которые не побоялись бы предать гласности свои генетические подробности.
Набор информации, которую мы намереваемся собрать, будет включать нуклеотидную последовательность ДНК всех 46 хромосом человека, медицинские показатели в цифровом формате, в том числе те, которые в будущем позволят составить детальную карту состояния здоровья пациента (исчерпывающие данные об РНК и белке, антропометрические параметры, результаты магнитно-резонансной томографии и других детальных обследований и т.д.). Мы хотим также поместить клеточные линии, полученные от каждого из добровольцев, в хранилище Coriell при Национальном институте общих медицинских исследований. Все собранные сведения будут находиться в открытом доступе. Каждый ученый сможет воспользоваться ими для проверки своих гипотез и пополнять банк данных.
В качестве положительного примера открытого доступа к генетической информации приведу случай, который недавно произошел со мной. Мы уже перевели в режим on-line некоторые медицинские данные добровольцев, в частности мои. И вот некий гематолог из штата, расположенного в совсем другой части США, связался со мной и сообщил, что, как ему представляется, мне давно пора пройти тест на содержание холестерола в крови. Я последовал его совету и в результате изменил дозу принимаемых лекарств и перешел на соответствующую диету, устранив тем самым один из факторов риска по сердечно-сосудистым заболеваниям. Конечно, в будущем в подобных ситуациях мы вряд ли будем полагаться только на рекомендации прозорливых специалистов с другого конца земного шара. В нашем распоряжении будет целый арсенал специализированных программ, которые помогут выбрать оптимальную линию поведения.
Проект «Персональный геном» был одобрен экспертным советом Гарвардской медицинской школы. Он предполагает полную осведомленность всех добровольцев о возможных рисках, которым они подвергаются, открывая третьим лицам доступ к данным о своем геноме. Кроме того, каждый новый участник проекта должен ознакомиться с уже имеющейся базой данных, чтобы получить представление о ее характере.
Проект «Персональный геном» создаст прекрасные предпосылки для свершения новых открытий. Кроме того, он позволит проверить «на прочность» общественные институты и службы страхования. Проект не обещает немедленной прибыли, но плоды, которые он принесет, с лихвой окупят все усилия.
Об авторе:
Джордж Черч (George M. Church) – профессор генетики в Гарвардской медицинской школе, руководитель Гарвардского центра вычислительной генетики Липпера, Лаборатории геномной технологии министерства энергетики США и в Центрах совершенствования геномики при Национальных институтах здравоохранения. В круг его научных интересов входит создание и внедрение новых методов анализа и синтеза биомолекул.
«В мире науки», № 4-2006
В ближайшее десятилетие мы станем свидетелями появления новых технологий, которые превратят секвенирование ДНК в недорогую рутинную процедуру. Грядет эра персонифицированной медицины, и готовиться к ней нужно уже сегодня.
Когда в 1993 г. появился Интернет, многим показалось, что это произошло в одночасье, совсем не так, как пробивало себе дорогу в жизнь большинство новых технологий, когда с момента зарождения идеи до ее реализации проходили годы, а то и десятилетия. Однако Всемирная паутина возникла не на пустом месте. Должна была сложиться необходимая инфраструктура, в частности, появиться Интернет (1965-1995 гг.) и огромное число персональных компьютеров – некая «критическая масса», которая и привела к запуску компьютерной «цепной реакции».
Движущая сила любой инновации – способность улавливать появление спроса на ту или иную продукцию. Так, космическая программа, зародившаяся некогда в правительственных и научных кругах, уже содержала в себе ростки того технологического прорыва, который привел к широкому использованию искусственных спутников Земли в военных, промышленных и коммерческих целях. То же самое происходит сейчас в биотехнологии. Мы можем лишь предполагать, какие потребности общества, открытия и изобретения будут предшествовать ее триумфальному выходу на сцену и когда возникнут необходимые для этого инфраструктурные предпосылки.
В 1984–1985 гг. я был одним из тех, кто ратовал за реализацию проекта «Геном человека». Его первоочередной задачей было побуквенное «прочтение» всей генетической информации, записанной в геномной ДНК человека. Предполагалось, что работа займет около 15 лет, будет стоить $3 млрд. и завершится к 2005 г.
Нам удалось секвенировать 93% генома несколькими годами раньше запланированного срока, попутно был разработан целый ряд новых биологических методов. Их последующее усовершенствование позволило снизить стоимость процесса до $20 млн. при достаточно высокой точности. Правда, это предполагает проведение всей процедуры в одном из специализированных центров, занимающихся реализацией крупных научных проектов.
Когда стоимость секвенирования генома человека удастся снизить до $1 тыс., можно будет подумать о том, чтобы каждый из нас имел при себе такую бесценную «визитную карточку», как нуклеотидная последовательность всей его геномной ДНК. Она окажет неоценимую услугу при медицинском обследовании, выборе лекарственных препаратов, выявлении предрасположенности к тем или иным заболеваниям и т.д. Доступная цена позволит проводить сравнительный анализ геномов, который даст возможность понять различия между нами и установить первопричины многих болезней.
«Человеческая» геномика выходит далеко за рамки генома самого человека и включает исследование генетического материала разнообразных патогенных и полезных микроорганизмов, присутствующих в окружающей среде, пищевых продуктах и нашем организме. Возможно, когда-нибудь в повседневную жизнь войдут ежедневно обновляемые генетические карты этих агентов, на которые мы сможем ориентироваться точно так же, как, скажем, на сводки погоды. Бурное развитие нанотехнологий и промышленной биотехнологии подготовят почву для создания искусственных микроорганизмов, которые будут вырабатывать полезные вещества с необычными свойствами или выполнять функции мусорщиков, наводящих порядок в окружающей среде.
Стоимость подобных проектов, в том числе тех, о которых мы сегодня даже и не подозреваем, очень высока. Поэтому пока разработчики программы «Революционные методы секвенирования генома», финансируемой Национальными институтами здравоохранения США, ориентируют ее участников на то, чтобы снизить стоимость секвенирования генома человека до $100 тыс. к 2009 г. и до $1 тыс. к 2014 г. Первую группу ученых, которым удастся решить задачу, ждет солидное денежное вознаграждение. И, похоже, цель уже близка. Есть основания полагать, что менее чем через четыре года подобная процедура будет стоить около $20 тыс.
ДНК – крутой перелом
• Потенциал биотехнологии будет реализован в полной мере только тогда, когда ее инструментарий (например, секвенирование геномов) станет столь же доступным и недорогим, как персональные компьютеры.
• Чтобы снизить стоимость процедуры секвенирования, разработчики новых методов стараются сократить число подготовительных этапов, до предела миниатюризировать оборудование и проводить секвенирование миллионов молекул одновременно.
• Как только цель будет достигнута, на повестку дня встанет вопрос о том, в каком объеме и кто сможет иметь доступ к информации о личных генетических данных. Одной из задач проекта «Персональный геном» является разрешение подобных этико-социальных проблем.
ДНК клетки, приступающая к делению, претерпевает кардинальные изменения: двойная спираль раскручивается, цепи расходятся. На каждой из них начинается синтез комплементарных полинуклеотидов, на одной – непрерывный, на второй прерывистый. Его катализирует фермент под названием полимераза; другой фермент, лигаза, сшивает полинуклеотидные фрагменты в непрерывную цепь. Так из одной молекулы ДНК образуются две.
Многие методы секвенирования ДНК основаны на взаимной комплементарности цепей этой молекулы. Генетический алфавит состоит всего из четырех букв – азотистых оснований аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т). Основания противоположных цепей молекулы ДНК соединяются в соответствии с правилом комплементарности: А образует пару с Т, а С – с G. В результате такого взаимодействия образуется хорошо известная двойная спираль – структура, напоминающая винтовую лестницу. Живые организмы используют принцип комплементарности при копировании своего генетического материала и устранения повреждений в нем (репарации) (см. внизу). Он же лежит в основе амплификации целевых фрагментов ДНК и их последующего секвенирования с помощью метода, разработанного в конце 1970-х гг. Ф. Сангером (пп. 1-2).
Секвенирование ДНК по Сангеру
1. Перед секвенированием по методу Сангера молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2. ПЦР состоит в следующем. Образец ДНК нагревают до температуры, при которой происходит расхождение цепей. Затем в реакционную смесь добавляют дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и праймер – короткий олигонуклеотид, комплементарный небольшому сегменту ДНК-матрицы. Он гибридизуется с этим сегментом, и ДНК-полимераза последовательно присоединяет к его концу dNTP, комплементарные нуклеотидам копируемой цепи. Процесс многократно повторяют, пока не получат миллионы копий каждого фрагмента.
3. Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырем пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.
4. Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определенной длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.
Методы секвенирования ДНК
Геном человека состоит из трех миллиардов пар нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит одно из четырех азотистых оснований – А, С, G или Т, составляющих тот алфавит, с помощью которого записывается генетическая информация в молекуле ДНК. Основания одной цепи ДНК спариваются с основаниями другой цепи по строго определенным правилам (А образует пару с Т, G – с С), поэтому достаточно определить последовательность оснований в одной из них.
Чтобы идентифицировать конкретное основание в какой-то области генома, необходим сенсор, способный заметить субнанометровое различие между А, Т, G и С. Единственный физический метод, обладающий столь высокой разрешающей способностью, – сканирующая туннельная спектроскопия. Однако при секвенировании последовательностей длиной в миллиарды звеньев чаще всего используются не физические, а химические способы.Геном человека был расшифрован с помощью методики, разработанной в конце 1970-х гг. американским биохимиком Фредериком Сангером. При этом процедуре секвенирования предшествует разрезание исследуемой молекулы ДНК на фрагменты, клонирование их в E. сoli и многократная дупликация для получения миллионов копий каждого фрагмента. В результате последнего раунда дупликации, проводимого в особых условиях, получают набор копий фрагментов разной длины, каждый из которых заканчивается флуоресцентно меченым нуклеотидом. Фрагменты разделяют по длине с помощью электрофореза, регистрируют световой сигнал от каждого из них по мере прохождения через детектор и получают нуклеотидную последовательность исходной цепи.
К достоинствам метода Сангера относятся его относительная простота и высокая точность, но, несмотря на последующие усовершенствования, он остается дорогим и трудоемким. Задача создателей альтернативных путей секвенирования состояла в повышении скорости процедуры и ее удешевлении. Для этого нужно было исключить этапы разделения, занимающие много времени, миниатюризировать всю систему, сохранив при этом возможность прочитывать последовательности миллионов фрагментов.
Многие исследовательские группы положили в основу своих разработок биосинтез – процесс, который используют живые организмы при воспроизведении своего генома и устранении в нем повреждений. Так, в клетке, готовящейся к делению, двойная спираль ДНК расплетается, составляющие ее цепи расходятся, а затем на каждой из них синтезируется новая цепь (на одной – непрерывно, на другой – прерывисто, с образованием отдельных фрагментов). Процесс последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи катализируется особым ферментом ДНК-полимеразой. Другой фермент, лигаза, сшивает фрагменты. В результате образуются две новые полноразмерные полинуклеотидные цепи, комплементарные тем ДНК-матрицам, на которых они синтезировались.
Методы секвенирования при помощи биосинтеза берут за основу те стадии упомянутого процесса, которые протекают на одиночной цепи секвенируемой ДНК. Регистрируется момент присоединения к праймеру, гибридизовавшемуся с ДНК-матрицей, комплементарного нуклеотида (удлинение цепи), или момент сшивания лигазой праймера с олигонуклеотидным зондом, содержащего известный нуклеотид в определенной позиции.
Существуют разные способы регистрации данных процессов, но обычно используется один из двух типов сигналов. Если меткой служит присоединенный к нуклеотиду флуорофор, то регистрируется испускаемый им свет определенной длины волны. Флуоресцентное детектирование применяют при секвенировании как методом удлинения цепи, так и методом лигирования. Его используют многие исследователи, среди которых – Майкл Мецкер (Michael Metzker) из Университета Бэйлора, Роби Митра (Robi Mitra) из Вашингтонского университета, а также возглавляемая мною лаборатория в Гарвардской медицинской школе и в корпорации Agencourt Bioscience.
Другой подход основан на регистрации биолюминесценции, которая инициируется связыванием с белком люциферазой (его синтезируют хорошо знакомые нам светлячки) пирофосфата, высвобождаемого после присоединения к праймеру очередного нуклеотида. Он создан Мустафой Ронаги (Mostafa Ronaghi) из Стэнфордского университета и применяется фирмами Pyrosequencing/Biotage и 454 Life Sciences.
В обоих случаях для получения достаточно сильного сигнала приходится проводить одновременно большое число реакций комплементарного спаривания и тестировать сразу множество копий целевой последовательности. Правда, предпринимаются попытки создать метод детектирования, позволяющий улавливать сигнал от одной молекулы. Над этим работают Стивен Квейк (Stephen Quake) из Калифорнийского технологического института и фирмы Helicos Biosciences и Nanofluidics. Если их усилия увенчаются успехом, то существенно сократится и стоимость процедуры секвенирования, и время ее проведения.
При детектировании флуоресценции одной молекулы 5% сигналов не улавливается, и, чтобы ликвидировать возникающие в результате пробелы в последовательности, приходится проводить считывание несколько раз. По этой причине многие предпочитают вначале амплифицировать секвенируемую цепь ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Здесь тоже разработан целый ряд новых подходов, позволяющих обойтись без предварительного клонирования ДНК в бактериальных клетках.
Один из них – бесклеточная система амплификации, созданная Эриком Кавасимой (Eric Kawashima) из Института фармакологических исследований Сероно в Женеве, Александром Четвериным из Института белка РАН в г. Пущино и Роби Митрой из Гарвардского университета. Метод состоит в создании с помощью ПЦР отдельных молекулярных колоний (миллионов копий одной-единственной молекулы ДНК) прямо на предметном стекле микроскопа или на пластинке геля. Каждая такая колония (в англоязычной литературе ее называют polony, от PCR-colony) не превышает в диаметре одного микрона, и на одной подложке их помещается до нескольких миллиардов.
Молекулярные колонии можно выращивать также на крошечных бусинках, заключенных в масляной капле – своеобразной камере для проведения ПЦР. Миллионы таких бусин, покрытых копиями ДНК-матриц, фиксируют на гелевой пластине и проводят одновременное секвенирование всех молекул.
Список методов амплификации матриц, их секвенирования и регистрации сигнала велик. Так, в основе одного из альтернативных методов лежит способность цепей ДНК спариваться (гибридизоваться) лишь с комплементарными последовательностями. Способ, впервые примененный компаниями Affymetrix, Perlegen Sciences и Illumina, получил широкое распространение. Его используют прежде всего для выявления минимальных различий в нуклеотидных последовательностях уже идентифицированных генов. Для этого синтезируют короткие одноцепочечные ДНК со всеми мыслимыми последовательностями и фиксируют их на большой подложке. Затем с ними инкубируют копии матрицы, которую хотят секвенировать, и регистрируют интенсивность флуоресценции. Чем точнее соответствие между матрицей и фиксированной на подложке последовательностью, тем сильнее флуоресцения. В такой тест на специфичность гибридизации иногда включают дополнительную стадию – удлинение цепи.
Один из наиболее перспективных методов секвенирования использует для идентификации оснований в молекуле ДНК совсем другой принцип – физическое различие между четырьмя нуклеотидами, А, Т, G и С. Одноцепочечную ДНК протягивают через пору диаметром 1,5 нм, пронизывающую мембрану, и регистрируют изменение электропроводности последней по мере поочередного прохождения нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение электропроводности, что и позволяет прочитать нуклеотидную последовательность цепи. Метод разработан Дэном Брэнтоном (Dan Branton) из Гарварда, Дейвом Димером (Dave Deamer) из Калифорнийского университета (г. Санта-Крус) и автором этой статьи Джорджем Черчем (George M. Church) и апробируется сейчас компанией Agilent Technologics.
Альтернативный метод детектирования использует не флуоресценцию нуклеотида, а биолюминесценцию белка, возбуждаемую присоединением к нему пирофосфата, который отщепляется от dNTP в момент его включения в растущую цепь.
Другие методы секвенирования
Следующие два метода секвенирования (удлинение цепи и лигирование) основываются на многократном повторении определенных биохимических реакций (внизу). Чтобы ускорить процесс и снизить его стоимость, ученые стремятся уменьшить их число, миниатюризировать систему и проводить секвенирование миллионов фрагментов ДНК одновременно
Удлинение цепи
Одноцепочечный фрагмент ДНК, называемый матрицей, вместе с коротким олигонуклеотидом, комплементарным ее концевому участку, фиксируют на подложке (а). Добавляют флуоресцентно меченные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и полимеразу, которая присоединяет к концу праймера dNTP, комплементарный соответствующему звену матрицы (б). Несвязавшиеся dNTP и полимеразу удаляют с помощью лазера, возбуждают флуоресценцию присоединенного к праймеру нуклеотида и идентифицируют его (в). Удаляют флуорофор и продолжают удлинение цепи.
Лигирование
К одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать (а). Синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырех нуклеотидов – А, Т, G или С (б). После того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером (в). Этот момент фиксируют, идентифицируют зонд, удаляют с матрицы комплекс и повторяют всю процедуру.
Амплификация
Световой сигнал от одной молекулы, сигнализирующий о моменте присоединения к праймеру очередного нуклеотида или сшивании праймера с зондом, очень слабый. Чтобы усилить его, удлинение цепи или лигирование проводят одновременно на миллионах копий одной матрицы. Копии получают в бесклеточной системе одним из двух способов (а и б), используя в обоих случаях ПЦР.
а) Молекулярные колонии образуются прямо на стеклянной пластинке или на пластине геля. Они состоят из миллионов копий одной и той же матрицы.
б) Масляная капля с включенной в нее полимеразой служит миниатюрной реакционной камерой. Матрица, фиксированная на стеклянной бусинке, проникает внутрь капли, и на ней образуется до 10 миллионов копий
Мультиплексные системы
Чтобы максимально ускорить процесс, секвенируют одновременно тысячи и даже миллионы разных фрагментов матрицы. Для этого их фиксируют на одной подложке и проводят реакцию удлинения цепи с регистрацией флуоресценции.
Альтернативный подход состоит в иммобилизации бусинок с миллионами копий матрицы и одновременном их секвенировании методом лигирования. Здесь показан микроскопический участок (0,01%) стеклянной подложки, покрытой светящимися молекулярными колониями.
Снижение стоимости секвенирования
Интересно было сравнить новые системы секвенирования ДНК друг с другом и с методом Сангера, что недавно и попытались сделать две исследовательские группы – одна из компании 454 Life Sciences, вторая из Гарвардской медицинской школы.
Мои коллеги и я описали систему секвенирования методом лигирования, в которой используется амплификация ДНК-матрицы на бусинках (диаметром один микрон) и обычный цифровой микроскоп для идентификации импульсов флуоресценции. Ученые из 454 Life Sciences амплифицировали ДНК-матрицу таким же способом (диаметр бусинок составлял 28 микрон), но секвенирование проводили методом удлинения цепи и детектировали биолюминесценцию белка после связывания с ним пирофосфата. Объектом секвенирования в обоих случаях была последовательность длиной 30 млн. нуклеотидов. Скорость процесса составляла 400 и 1,7 тыс. звеньев в секунду для первой и второй систем соответственно. Чтобы повысить точность, секвенирование обычно многократно повторяют. При 43 повторах, произведенных группой 454 Life Sciences, точность составила одну ошибку на 2,5 тыс. звеньев, а наша группа совершила 7-кратное секвенирование с точностью одна ошибка на 3 млн.
Минимальная цена секвенирования с использованием гель-электрофореза составляет $1 за 150 п.н. Во что обошлась работа группе 454 Life Sciences – не сообщается, а мы за $1 расшифровали последовательность длиной 1,4 тыс. п.н., т.е. наш метод оказался экономичнее примерно в девять раз.
Есть основания полагать, что очень скоро цена секвенирования геномной ДНК человека снизится до $100 тыс. Теперь, когда сам процесс уже автоматизирован, удешевить его можно за счет уменьшения количества реагентов и снижения стоимости оборудования. Благодаря миниатюризации системы количество реагентов уже стало в миллиард раз меньше: если в методе Сангера реакционный объем составлял несколько микролитров, то сегодня – несколько фемтолитров.
Многие современные системы анализа изображений считывают данные со скоростью один миллиард байт в минуту, а компьютеры обрабатывают информацию со скоростью несколько миллионов операций в секунду. Чтобы использовать их возможности в полной мере, нужно существенно уменьшить характерное время физических и химических процессов, вовлеченных в секвенирование (таких как электрофорез или ферментативные реакции), что нереально, или же сделать всю систему более компактной как в пространстве, так и во времени.
Сравнивая новые и старые пути секвенирования, следует учитывать еще один момент. Современные способы чаще всего считывают последовательности короткими сегментами длиной от 5 до 400 п.н., а для метода Сангера их величина обычно составляет 800 п.н. Таким образом, расшифровка неизвестных геномов, включающая их «склеивание» из обрывков, для новых методов представляется более трудной задачей. Впрочем, если основной целью секвенирования станет выявление минимальных вариаций в ДНК в медицинских целях, то небольшая длина прочитываемых фрагментов не породит новых проблем.
Требования к точности секвенирования зависят от того, в каких целях оно проводится. Если речь идет о диагностике, то нынешняя ошибка в 0,01%, с которой расшифрован геном человека, слишком велика, поскольку она означает, что 600 тыс. позиций в нем ошибочны. С другой стороны, для классификации различных РНК и тканей приемлемой считается ошибка в 4%, типичная для анализа генома методом случайной выборки.
Секвенирование с помощью нанопор
Отрицательно заряженная одноцепочечная ДНК проходит через нанометровую пору в мембране, наружная поверхность которой несет отрицательный заряд, а внутренняя – положительный (а). Как только очередной нуклеотид перекрывает внутреннее отверстие в поре, электропроводность мембраны (измеряемая здесь в пикоамперах) изменяется. Нуклеотиды разного типа, из которых состоит цепочка ДНК, немного различаются по размерам и поэтому закрывают пору в большей или меньшей степени и на разное время (б). Соответственно этому изменяется и электропроводность (в). Если удастся существенно повысить разрешающую способность метода, то каждый скачок электропроводности будет отвечать прохождению через пору одного нуклеотида, и с диаграммы, получаемой на выходе, можно будет считывать нуклеотидные последовательности (г). Секвенирование генома человека займет в этом случае всего 20 часов, поскольку многократной амплификации матрицы не понадобится.
[lib]pogenomu10.jpg [/lib]
[lib]pogenomu11.gif [/lib]
Готовность номер один
Помимо разработки новых методов секвенирования, нужно обеспечить возможность их незамедлительного применения. Необходимы компьютерные программы, способные обрабатывать информацию таким образом, чтобы она была понятна пользователям, например врачам. Возможно, возникнет потребность в составлении для каждого пациента индивидуального перечня наиболее значимых генетических вариаций. Не менее важно предусмотреть все последствия широкого распространения новых технологий для человеческого сообщества.
Еще на первых этапах реализации проекта «Геном человека» было принято решение о выделении ежегодно $10 млн. на анализ возникающих по ходу дела этических и социальных проблем. Участники проекта договорились, что вся информация должна быть обнародована не позднее чем через неделю с момента ее получения, при этом следует пресекать все попытки ее коммерциализации. Предметом особой заботы стало сохранение анонимности персональных данных, на основании которых была построена карта генома «усредненного человека», опубликованная в печати. Но многие серьезные вопросы так и остались без ответа. Главный из них – как предотвратить несанкционированное использование личной геномной информации человека учеными, медиками, страховыми агентствами, работодателями, органами юстиции, директорами школ и высших учебных заведений, правительственными организациями и т.д.
Осознавая важность данных проблем и трудность их разрешения, я и мои коллеги выступили с инициативой разработки проекта «Персональный геном», который предусматривает проведение детального анализа всех последствий открытости генетических данных.
Мы помним, как изменилась экономика, наука и вся наша жизнь с появлением персональных компьютеров. Не менее масштабные перемены ожидают нас после того, как расшифровка генома человека станет обычным делом, и мы должны быть готовы к этому.
Проект «персональный геном»
Джордж Черч, сфотографированный на фоне переливающихся всеми цветами радуги молекулярных колоний, будет одним из первых, кто предоставит данные о своем геноме всем желающим.
Уже многие годы каждый новорожденный перед выпиской из родильного дома проходит тест на фенилкетонурию, одно из наследственных заболеваний. Сегодня многих больных раком легких определенной формы проверяют на наличие в их геноме вариантных форм гена EGFR, чтобы оценить целесообразность проведения химиотерапии с применением препарата Iressa. К генетическим тестам все чаще прибегают для того, чтобы подобрать больному дозу необходимого лекарства с учетом особенностей его метаболизма. Все свидетельствует о том, что мы стоим на пороге появления персонифицированной медицины, дело лишь за тем, как скоро удастся снизить стоимость процедуры секвенирования генома человека.
Персональный геном содержит информацию, интересную не только с медицинской, но и с генеалогической точки зрения. С его помощью можно узнать, каковы наши корни, связаны ли мы родственными узами с теми или иными людьми. Тысячи или даже миллионы наборов данных, заключенных в полной нуклеотидной последовательности геномной ДНК, помогут ответить, например, на такой вопрос: «Какие генетические особенности и взаимодействия между генами и окружающей средой формируют наш внешний облик или отвечают за те или иные черты характера?»
Доступ к информации о генетическом статусе человека открывает невиданные возможности, но тут же встает вопрос о правомочности ее использования страховыми агентами, работодателями, политиками и т.д.
Пройдет немало времени, прежде чем мы ощутим, насколько изменилась наша жизнь с наступлением эры персонифицированной геномики. Чтобы заглянуть в будущее, я и мои коллеги недавно приступили к реализации идеи «Персональный геном», который мы рассматриваем как логическое продолжение проекта «Геном человека». Мы намереваемся оценить возможные опасности и риски персональной геномики и собираемся привлечь добровольцев, которые не побоялись бы предать гласности свои генетические подробности.
Набор информации, которую мы намереваемся собрать, будет включать нуклеотидную последовательность ДНК всех 46 хромосом человека, медицинские показатели в цифровом формате, в том числе те, которые в будущем позволят составить детальную карту состояния здоровья пациента (исчерпывающие данные об РНК и белке, антропометрические параметры, результаты магнитно-резонансной томографии и других детальных обследований и т.д.). Мы хотим также поместить клеточные линии, полученные от каждого из добровольцев, в хранилище Coriell при Национальном институте общих медицинских исследований. Все собранные сведения будут находиться в открытом доступе. Каждый ученый сможет воспользоваться ими для проверки своих гипотез и пополнять банк данных.
В качестве положительного примера открытого доступа к генетической информации приведу случай, который недавно произошел со мной. Мы уже перевели в режим on-line некоторые медицинские данные добровольцев, в частности мои. И вот некий гематолог из штата, расположенного в совсем другой части США, связался со мной и сообщил, что, как ему представляется, мне давно пора пройти тест на содержание холестерола в крови. Я последовал его совету и в результате изменил дозу принимаемых лекарств и перешел на соответствующую диету, устранив тем самым один из факторов риска по сердечно-сосудистым заболеваниям. Конечно, в будущем в подобных ситуациях мы вряд ли будем полагаться только на рекомендации прозорливых специалистов с другого конца земного шара. В нашем распоряжении будет целый арсенал специализированных программ, которые помогут выбрать оптимальную линию поведения.
Проект «Персональный геном» был одобрен экспертным советом Гарвардской медицинской школы. Он предполагает полную осведомленность всех добровольцев о возможных рисках, которым они подвергаются, открывая третьим лицам доступ к данным о своем геноме. Кроме того, каждый новый участник проекта должен ознакомиться с уже имеющейся базой данных, чтобы получить представление о ее характере.
Проект «Персональный геном» создаст прекрасные предпосылки для свершения новых открытий. Кроме того, он позволит проверить «на прочность» общественные институты и службы страхования. Проект не обещает немедленной прибыли, но плоды, которые он принесет, с лихвой окупят все усилия.
Об авторе:
Джордж Черч (George M. Church) – профессор генетики в Гарвардской медицинской школе, руководитель Гарвардского центра вычислительной генетики Липпера, Лаборатории геномной технологии министерства энергетики США и в Центрах совершенствования геномики при Национальных институтах здравоохранения. В круг его научных интересов входит создание и внедрение новых методов анализа и синтеза биомолекул.
«В мире науки», № 4-2006
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Последние комментарии
