Вакцины завтрашнего дня

С.Н.Щелкунов, Р.К.Саляев

В мае 1796 года произошло событие «ценою» в миллионы
спасенных человеческих жизней. Английский врач Эдуард Дженнер открыл способ предохранения
от грозного заболевания – натуральной оспы – путем заражения легкой формой
схожего заболевания, оспой коров. Эстафету Дженнера принял знаменитый
французский ученый Луи Пастер – настоящий «микробный» Леонардо Да Винчи XIX
века. С этого времени вакцинация (от лат. vaccus – корова) стала наиболее
популярным, эффективным и доступным способом защиты населения от заболеваний,
вызванных патологическими микроорганизмами, особенно – вирусами,
фармацевтические препараты против которых практически отсутствуют.

Суть вакцинации заключается в том, что в организм вводятся
убитые или ослабленные микробы, что обеспечивает развитие у человека
иммунитета, т. е. невосприим чивости к болезни. Патогенные агенты «несут» на
себе антигены, молекулы разной природы (белки, полисахариды и т. д.), которые распознаются
организмом и вызывают защитный иммунный ответ. Первые вакцины получали методом
проб и ошибок, но в наше время, благодаря развитию молекулярной биологии и
генетической инженерии, открылись небывалые возможности для создания новых
способов иммунизации и новых вакцин. Среди них – ДНК-вакцины на основе
генно-инженерных плазмид, микрокапсулированные и «леденцовые» вакцины с
углеводом трегалозой, синтетические вакцины из искусственно синтезированных
белков и полисахаридов...

Требования к новым вакцинам едины: они должны быть
безопасными, недорогими, простыми в использовании, длительно сохраняться и
транспортироваться без использования холодильного оборудования. Все эти
требования сполна удовлетворяют вакцины на основе генетически модифицированных растений
со встроенными фрагментами ДНК патогенных микроорганизмов: их применение может
стать революционным событием в профилактической медицине.

Съел – и в порядке!

В чем же состоит уникальность и привлекательность такого
типа вакцин – съедобных? Во-первых, сам способ иммунизации – оральный, т. е.
через рот – является простым, удобным и безопасным, так как снижает риск заражения
другими микроорганизмами по сравнению с инъекциями или скарификацией,
нарушающими кожные покровы. Во-вторых, съеденная вакцина попадает прямиком в
желудочно-кишечный тракт, а конкретно – к его слизистым оболочкам.

Слизистые (иначе мукозные, от англ. mucosal) оболочки
пищеварительного, дыхательного и мочеполового трактов являются обычными местами
проникновения и колонизации для многих патогенных микроорганизмов. Защита этих
оболочек обеспечивается иммунокомпетентными клетками, организованными в
специальные лимфоидные ткани. Эта так называемая мукозная иммунная система
является первым барьером на пути инфекций в отличие от исторически первой
изученной системной иммунной системы, обеспечивающей защиту внутренних органов
организма.

Стимуляция гуморального иммунитета в резуль тате инъекционной
вакцинации обычно эффективно предотвращает системные инфекции, но при этом не
защищает слизистые оболочки. Мукозная же иммунизация чаще всего приводит к
стимуляции как мукозного, так и системного иммунных ответов. Однако проводить
иммунизацию через слизистые оболочки непросто из-за ряда физиологических барьеров,
препятствующих проникновению антигенов. Оболочка же растительных клеток
обеспечивает антигену естественную защиту при прохождении через пищевод и
желудок с кислым пищеварительным соком. Затем «упакованный» антиген
благополучно достигает кишечника и соответственно, – мукозной иммунной системы.

Привлекательным свойством растительных вакцин является не
только их потенциальная дешевизна, простота хранения и применения, но и
огромный спектр самих пищевых прототипов – овощей, фруктов, злаков. Более того,
можно создать растения, продуцирующие одновременно антигены разных инфекционных
агентов, т.е. съедобные многокомпонентные вакцины! Не такой ли – почти
«идеальной» – представлялась вакцина будущего основоположникамвакцинологии
более 200 лет назад?

Начинка для Сеньора Помидора

Саму идею создания трансгенных растительных вакцин высказал
в 1992 году американец Х. Мейсон. Через три года исследователи предприняли
успешную попытку получения вакцины против гепатита В на основе трансгенного
табака, в котором синтезировался поверхно стный антиген (HBsAg) вируса.
Рекомбинантный белок, выделенный из табака, при инъекции мышам вызывал у них
такой же специфичный иммунный ответ, как и при использовании стандартной
трансгенной вакцины из дрожжей. Затем был создан трансгенный картофель, продуцирующий
HBsAg, а в 1999 году были начаты эксперименты на добровольцах, давшие положительный
результат.

В последнее время одним из самых важных и перспективных направлений
в создании съедобных вакцин считается использование растений, которые могут широко
использоваться в пищу без термообработки. Ученые из Государственного научного
центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (наукоград Кольцово, Новосибирская
область) в содружестве с сотрудниками Сибирского института физиологии и
биохимии растений СО РАН (г. Иркутск) и новосибирского Института химической
биологии и фундаментальной медицины СО РАН поставили перед собой задачу создать
кандидатные съедобные вакцины против вируса гепатита В человека и вируса иммунодефицита
человека на основе трансгенных растений томата. Проект получил финансовую
поддержку Министерства сельского хозяйства США (грант № 2176р Международного
научно-технического центра).

Вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатита В, к
сожалению, хорошо известны и не нуждаются в «рекламе». Отметим только, что в
современном мире распространение этих инфекций приобретает характер эпидемии.
По данным ВОЗ, смертность от СПИДа достигает 2-3 млн, а от гепатита В – 1 млн
человек в год! Поэтому неудивительно, что эти болезни привлекают к себе
пристальное внимание биотехнологов во всем мире.

Конструируем химеру

В создании генно-инженерных вакцин существует несколько
подходов. При первом – в качестве встраиваемого фрагмента используется реальный
ген инфекционного агента. Более нетрадиционным и многообещающим является
конструирование генов, кодирующих искусственные белки, так называемые синтетические
вакцины. Это – молекулы с заранее заданной третичной структурой и с оптимально
подобранным составом эпитопов, т. е. «активных» центров инфекционного антигена,
которые и запускают каскад иммунных реакций организма.

На основе этой методологии сотрудником ГНЦ ВБ «Вектор» А. М.
Ерошкиным вместе с коллегами был рассчитан полиэпитопный белок-иммуноген против
ВИЧ, названный ТВI (Tand B-cellular immunogen). Затем для этого белка
синтезировали кодирующую ДНК-последовательность и встроили ее в кишечную палочку
E. coli. У животных, иммунизированных полученным рекомбинантным белком, был
обнаружен как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ против вируса
иммунодефицита, что доказало правильность используемого подхода.

Генетическая конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность,
кодирующую TBI-HBs — полиэпитопный белок-иммуноген против ВИЧ-инфекции и гепатита В.

Исследователи пошли дальше по пути создания именно съедобных
вакцин. Было решено встроить подобную генетическую конструкцию в растения томатов,
в результате чего в них должен был синтезироваться «неприродный» белок. И не
просто искусственный, но еще и химерный, поскольку к набору из девяти иммуногенных
эпитопов белков ВИЧ-1 (TBI) был добавлен еще и поверхностный антиген вируса
гепатита В (HBsAg).

В результате ожидалось получить мультивалентную синтетическую
вакцину одновременно против двух вирусных заболеваний. Генетические конструкции
для переноса в растения были созданы сотрудниками «Вектора» и ИХБиФМ, а перенос
их в растения томата и селективный отбор трансгенных растений осуществили сотрудники
СИФИБРа.

Цена «золотых яблок»

В листьях и плодах полученных трансгенных растений томата
действительно были обнаружены антигенные детерминанты TBI и HBsAg, что,
безусловно, подтверждало синтез в них целевого химерного белка TBI-HBsAg. Чтобы
избежать возможной ошибки, определение белка иммуноферментными методами проводи
лось независимо в СИФИБРе и «Векторе». Но вот вопрос – оправдают ли эти
аппетитные помидорчики свое итальянское имя – «золотые яблоки»? Иначе – будут
ли трансгенные плоды «работать» как вакцина?

Из более чем 2000 генетически трансформированных проростков
томата было отобрано около двух десятков растений, у которых полимеразная
цепная реакция (ПЦР) показала присутствие в их тканях гена TBI-HBs.

1-9 – ДНК из плодов индивидуальных трансгенных растений; К – ДНК из плода
контрольного растения; A.t. – ДНК гена, клонируемого в плазмиде почвенной
бактерии Agrobacterium tumefaciens.

В листьях и плодах трансгенных томатов поколения Т1 обнаружен конечный продукт экспрессии
гена – химерный белок TBI-HBsAg. По уровню продукции белка наблюдалось клоновое
разнообразие, что обусловлено положением трансгена в геноме растения.

1-15 – плоды индивидуальных трансгенных растений; К – плод контрольного
растения.

Здесь следует обратить внимание на следующий нюанс. Вакцина –
не лекарство, она является лишь профилактическим средством. Как проверить ее
эффективность, особенно в случае тяжелейших, более того – смертельных заболеваний?
В этом случае нам, пожалуй, не стоит следовать не слишком гуманному примеру гениального
Дженнера, проверившего свое открытие на восьмилетнем ребенке. Нельзя ведь, в
самом деле, накормив добровольцев (если таковые и нашлись бы) помидорами, затем
заражать их ВИЧ-инфекцией и смотреть на результат?

Поэтому в «бой», как всегда, вступили лабораторные мыши.
Правда, СПИДом, как, впрочем, и гепатитом, мыши не болеют, однако их иммунная
система должна была отреагировать на интервенцию антигенного белка. Помидоры
мыши тоже недолюбливают, поэтому массу из измельченных плодов сотрудники
«Вектора» через катетер вводили животным прямо в пищевод. Для оценки же
мышиного иммунитета использовался стандартный иммуноферментный анализ (ИФА) на
наличие антител к вирусам гепатита В и ВИЧ-1. Эксперимент, в котором мышей
кормили помидорами три раза с интервалом в 2 недели, закончился совсем недавно –
в сентябре этого года. И его можно однозначно назвать успешным: уже после
второго кормления в крови иммунизированных животных значительно увеличился
уровень антител против вируса гепатита В. Более того, мукозный иммунный ответ,
судя по результатам анализа мышиных фекалий, начинался еще раньше – уже после
первого кормления – и сохранялся до конца эксперимента. В отношении ВИЧ картина
была схожей и, хотя уровни выявленных антител были не столь высоки, они
достоверно отличались от аналогичных анализов у контрольных животных, сидевших
на «диете» из обычных нетрансгенных томатов.

Таким образом, можно сказать, что кандидатная съедобная
вакцина одновременно против двух вирусных инфекций – гепатита В и ВИЧ-инфекции (СПИДа)
– в принципе получена. В этой фразе отметим два слова – в принципе и кандидатная,
которые, как макушка айсберга, обозначают проблему.

Вообще-то, планов у участников проекта много: кроме томатов,
хотелось бы использовать и другие привлекательные носители трансгенов,
например, морковь, сладкий перец, злаки, объединяя свои усилия с учеными из
других городов и институтов. А еще можно попробовать увеличить продуктивность
растений-вакцин, трансформируя не только их ядерный геном, но и генетический
материал многочисленных хлоропластов, в которых происходит фотосинтез. Судя по
нашим предварительным результатам, перспективным может оказаться
«комбинированный» путь, т. е. сочетание съедобной вакцины с инъекцией
плазмидных ДНК-вакцин. Эффективность полученной вакцины оценивалась косвенным
путем – почему бы не перейти к прямым клиническим испытаниям, например, на
приматах? Но в Сибири бананы не растут, а уж сколько стоят здесь обезьяны…

И так во всем: когда речь заходит о каких-то масштабных
проверках, доклинических и прочих, о выведении устойчивых трансгенных линий
растений, на передний план выходит сакраментальный для нашей страны призыв:
«Ищите деньги!». Пока будущее – в тумане. А для продолжения работ требуется не
менее 200 тысяч долларов в год. Интересно было бы знать – покрывает ли такая
сумма хотя бы суточные траты Центра исследования СПИДа, что под Вашингтоном?

Об авторах:
Щелкунов Сергей Николаевич – доктор биологических наук, заведующий
отделом молекулярной биологии геномов НИИ молекулярной биологии
Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (г.
Новосибирск), профессор Новосибирского государственного университета.

Саляев Рюрик Константинович – член-корреспондент РАН, доктор биологических
наук, главный научный сотрудник Сибирского института физиологии и биохимии
растений СО РАН (г. Иркутск), советник РАН, заведующий кафедрой физиологии растений
и клеточной биологии Иркутского государственного университета.

http://www.sciencefirsthand.ru