Лимфоциты-мутанты, антитела и иммунитет


Лимфоциты млекопитающих производят огромное количество разнообразных антител – защитных белков, избирательно связывающихся со всевозможными чужеродными молекулами (антигенами). Способность вырабатывать иммунитет к новым инфекциям основана на внесении в гены антител случайных изменений – мутаций и последующем размножении тех лимфоцитов, у которых мутации оказались наиболее удачными. В опытах с трансгенными мышами американские ученые показали, что мутирование генов антител начинается с целенаправленной замены цитозинов урацилами, после чего в результате неточной репарации (починки) ДНК мутации распространяются в обе стороны от каждого урацила на расстояние до 30 нуклеотидов.
B-лимфоциты человека и других млекопитающих способны синтезировать миллионы разнообразных антител. Как и все прочие белки, антитела синтезируются на основе «инструкций», записанных в генах. Однако число генов в геноме млекопитающих на много порядков меньше, чем число типов антител, производимых организмом в течение жизни. Организм не может запастись заранее всеми необходимыми генами антител по двум причинам: во-первых, такое количество генов не поместится ни в каком геноме (это привело бы к непомерному росту «расходов» на содержание в каждой клетке громадного количества ДНК), во-вторых, как бы ни был велик запас защитных генов, в любой момент может появиться новая инфекция, для борьбы с которой не подойдет ни одно из имеющихся антител.
Позвоночные животные решили эту проблему, выработав специальные механизмы для прижизненного редактирования своего генома. В частности, гены антител формируются в геноме B-лимфоцитов по мере необходимости из специальных «заготовок» (гены антител в норме не передаются по наследству – наследуются только «заготовки»). Этот творческий процесс основан на тех же принципах, что и биологическая эволюция, – на случайных мутациях и избирательном размножении удачных вариантов. Впрочем, в обоих случаях «случайность» мутаций – понятие весьма относительное. Оно означает лишь, что клетка не может знать заранее, к какому результату приведет та или иная конкретная мутация. Однако клетка вполне способна контролировать скорость мутагенеза и его приуроченность к тем или иным участкам генома. Редактирование генома, таким образом, осуществляется по принципу «оптимизированного случайного поиска».
Формирование генов антител в геноме B-лимфоцитов происходит в два этапа. Сначала, на ранних стадиях развития организма, гены антител формируются комбинаторным путем из унаследованного от родителей набора заготовок (подробнее см. здесь). Каждый B-лимфоцит продуцирует только один тип антител. На этом этапе неизбежно возникают «неудачные» лимфоциты, опасные для организма: они производят аутоантитела, атакующие собственные антигены (молекулы) организма. Такие лимфоциты выбраковываются, остальные сохраняются и размножаются. В результате животное получает большой набор B-лимфоцитов (и, соответственно, антител), способных атаковать почти любые молекулы, кроме тех, которые в норме присутствуют в данном организме.

Соматическое гипермутирование – процесс во многом загадочный. До сих пор о его механизмах было известно немногое. Было установлено, что в нём участвует особый фермент – цитидин-дезаминаза, индуцируемая активацией (activation induced (cytidine) deaminase, AID). Этот фермент атакует нуклеотиды Ц (цитозины) в V-области и отрывает от них аминогруппу (–NH2), превращая их тем самым в урацилы (У). После этого в окрестностях урацилов начинают появляться мутации (замены нуклеотидов). Мутагенез осуществляется при помощи систем репарации (починки) и репликации (удвоения, размножения) ДНК, которые в данном случае работают с большим количеством «ошибок». Многое оставалось неясным: в частности, было неизвестно, насколько необходимым является дезаминирование цитозинов для инициации гипермутирования; зависит ли число и характер мутаций от того, какой именно из цитозинов будет дезаминирован; распространяются ли мутации в обе стороны от дезаминированного цитозина или только в одну и т. д.
Чтобы прояснить детали этого процесса, биологи из Йельского университета (США) создали трансгенных мышей, которым в V-области генов антител были вставлены искусственно синтезированные фрагменты ДНК длиной в 100 нуклеотидов. Всего было использовано 4 таких фрагмента, каждый из которых вставлялся в геном одной из линий трансгенных мышей. В двух случаях из четырех фрагмент состоял только из нуклеотидов А и Т. В двух других в нём имелся один нуклеотид Ц и, соответственно, комплементарный ему нуклеотид Г в противоположной (комплементарной) цепи двухцепочечной молекулы ДНК. Фрагменты были вставлены таким образом, что у одних мышей ключевой нуклеотид Ц оказался в «нижней» (кодирующей) цепи ДНК, на основании которой синтезируется белок, а у других – в «верхней» (некодирующей).
Из B-лимфоцитов взрослых мышей выделяли ДНК и смотрели, какие мутации и в каком количестве появились во внедренном фрагменте. Оказалось, что если фрагмент не содержал нуклеотида Ц, то мутации в нём возникали лишь по краям – там, где расстояние до ближайшего Ц (расположенного за пределами внедренного фрагмента) не превышало 30 нуклеотидов. В центральной части вставленного участка ДНК мутации отсутствовали вовсе. Это означает, что присутствие цитозинов абсолютно необходимо для запуска процесса гипермутирования, и мутации распространяются лишь на небольшое расстояние от каждого Ц.
Если в середине фрагмента был нуклеотид Ц, расположенный в «верхней», некодирующей цепи ДНК, то мутации возникали в большом количестве по всей длине фрагмента. Однако если нуклеотид Ц оказывался в «нижней», кодирующей цепи, а в «верхней» напротив него располагался комплементарный ему нуклеотид Г, мутации не происходили (или заменялась только сама пара ГЦ, а окружающие ее нуклеотиды А и Т все оставались на своих местах). Таким образом, выяснилось, что сигналом для запуска процесса гипермутирования может служить только нуклеотид Ц, расположенный в «верхней» цепи ДНК. Может быть, это объясняется тем, что фермент AID каким-то образом отличает верхнюю цепь от нижней и дезаминирует цитозины только в верхней цепи? Авторам удалось показать, что это не так, что цитозины обеих цепей подвергаются дезаминированию в равной степени. Однако в нижней цепи это приводит к замене другим нуклеотидом только самого цитозина, а в верхней – также и к замене многих соседних нуклеотидов.
Особенно часто мутации происходят на расстоянии в 4–15 нуклеотидов по обе стороны от дезаминированного цитозина в верхней цепи. По мнению авторов, ключевую роль здесь играет система репарации (починки) ДНК. Белки, осуществляющие репарацию, находят в верхней цепи дезаминированный цитозин (урацил) и начинают «исправлять ошибку». Вероятно, они при этом вырезают довольно большой кусок ДНК вокруг «испорченного» нуклеотида, а потом не слишком аккуратно его восстанавливают. Так и появляются многочисленные мутации. По-видимому, за починку верхней и нижней цепи отвечают разные системы репарации, причем первые работают с ошибками, а вторые – без. При помощи ряда дополнительных экспериментов ученым удалось выявить конкретные белки, ответственные за «неаккуратную починку» верхней цепи ДНК в V-областях (Msh2/6, Exo1, ДНК-полимераза η).
Данное исследование – важный шаг к пониманию того, каким образом живая клетка может контролировать изменения собственного генома. Однако вопросов по-прежнему остается много. Например, очень хотелось бы узнать, каким образом фермент AID находит V-область и как клетка определяет, к каким из «испорченных» нуклеотидов нужно направить точные, а к каким – склонные к ошибкам системы репарации. Наконец, эволюционистов-теоретиков не может не волновать крамольный вопрос: что если механизм гипермутирования иногда включается не только в лимфоцитах?
Источник: Shyam Unniraman, David G. Schatz. Strand-Biased Spreading of Mutations During Somatic Hypermutation // Science. 2007. V. 317. P. 1227–1230.
Александр Марков, http://elementy.ru
