Сравнительный анализ реагентов для ИФА четырех фирм-производителей

Сравнительный анализ определения концентрации ряда аналитов в сыворотке крови с использованием коммерчески доступных наборов реагентов четырех фирм-производителей (Алкор Био, Roche, DPC и Bayer Corporation).

М. Е. Урусова^1*, В. А. Головаченко¹, Е. П. Гитель², В. Г. Колодько³, Н. Д. Фанченко³, Д. Г. Полынцев¹

¹Лаборатория инфекционной диагностики, Лаборатория гормональной диагностики, ЗАО Алкор Био, Санкт-Петербург

²Отдел гормональных исследований, Клиника акушерства и гинекологии ММА им. И. М. Сеченова, Москва

³Лаборатория эндокринологии Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва

^*Автор для переписки: Урусова Мария Евгеньевна, 197110, Санкт-Петербург, а/я 243; тел. (812)-596-6775, факс (812)-596-6780, E-mail popicherep@yahoo.com или alkorbio@peterlink.ru

Целью настоящей работы было определение концентрации кортизола, прогестерона, тестостерона, трийодтиронина, тироксина, хорионического гонадотропина, пролактина, a-фетопротеина, лютеинизирующего, фолликулостимулирующего и тиреотропного гормонов в сыворотках крови людей, а также в контрольных сыворотках Lyphochek^® Immunoassay Plus Control (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) с помощью наборов реагентов четырех фирм-производителей (Алкор Био, Roche (автоматический анализатор Roche Cobas Core), DPC (автоматический анализатор Immulite^®) и Bayer (автоматический анализатор ACS:180)). Мы обнаружили согласованность и корреляцию между наборами этих систем, причем степень этой согласованности убывает в ряду Алкор Био/Bayer, Алкор Био/Roche, Алкор Био/DPC.

Введение

Метод иммуноферментного анализа (9) широко используется для клинического определения большого количества антигенов и антител в сыворотке крови человека. Этот метод характеризуется скоростью и простотой в исполнении процедур, высокой чувствительностью и специфичностью, а также отсутствием в составе наборов опасных для здоровья реактивов. В настоящее время, на мировом рынке существует большое количество наборов реагентов от разных фирм-производителей для определения различных аналитов (гормонов, онкомаркеров и пр.). В данной работе мы хотели сравнить значения концентрации ряда аналитов в сыворотке крови, измеренных с помощью коммерчески доступных тест-систем четырех фирм-производителей: Алкор Био, Diagnostic Products Corporation, Roche и Bayer Corporation. В частности, мы использовали наборы для определения кортизола, прогестерона, тестостерона, трийодтиронина, тироксина, хорионического гонадотропина (ХГч), пролактина, a-фетопротеина, лютеинизирующего (ЛГ), фолликулостимулирующего (ФСГ) и тиреотропного гормонов (ТТГ). Для дополнительного контроля качества наборов компании Алкор Био мы применяли контрольные сыворотки Lyphochek^® Immunoassay Plus Control (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California).

Материалы и методы

Образцы сыворотки крови. Все образцы сыворотки крови собирались в отделе гормональных исследований Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И. М. Сеченова (далее – ОГИ) и в лаборатории эндокринологии (далее – ЛЭ) Научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН от пациентов, проходящих обследование в этих лабораториях. Предварительно в образцах измерялись значения определенных аналитов с помощью коммерческих тест-систем (см. Табл.2). После этого данные образцы были любезно предоставлены в нашу лабораторию для последующих исследований.

Таблица 2. Тест-системы, использованные для определения различных аналитов

Для контроля качества проводимых анализов мы использовали контрольные сыворотки Lyphochek^® Immunoassay Plus Control (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) трех уровней (Cat. No. 370, Lot No. 40090).

Методы определения аналитов. Использованные в работе наборы реагентов представлены в Табл.3. Все процедуры проводились согласно инструкциям, прилагаемым к наборам (2-5).

Таблица 3. Наборы реагентов, использованные в настоящем исследовании.

Наборы реагентов в системе автоматического анализатора Immulite^® основываются на иммуноферментном анализе с использованием полистироловых шариков в качестве твердой фазы, щелочной фосфатазы в качестве фермента и хемилюминесцентного субстрата (4).

В наборах реагентов для автоматического анализатора Roche Cobas Core также применяются полистироловые шарики в качестве твердой фазы для иммуноферментного анализа, фермент – пероксидаза хрена и хромоген – 3,3’,5,5’,-тетраметилбензидин (ТМБ) (5).

Наборы реагентов в системе автоматического анализатора ACS:180 используют принцип прямой хемилюминесценции с магнитными частицами в качестве твердой фазы и акридиновым эфиром в качестве хемилюминесцентной метки (3).

Наборы реагентов Алкор Био предназначены для проведения анализа вручную и основаны на иммуноферментном анализе с 96-луночными разборными микротитровальными планшетами в качестве твердой фазы, пероксидазой хрена в качестве фермента и ТМБ в качестве хромогена (2).

Методы статистического анализа. Для оценки зависимости между данными, полученными в нашей лаборатории, в ЛЭ и в ОГИ применялся коэффициент корреляции Пирсона (r) (1,7,8), для определения характера этой зависимости мы использовали построение линейной регрессии на диаграммах рассеяния (1,7,8).

Результаты и обсуждение

Определение кортизола.

Из данных, представленных на рис. 1, следует, что при определении концентрации кортизола наблюдается высокий уровень корреляции в данных, полученных нашей лабораторией и ЛЭ, однако с ОГИ корреляция значительно ниже. Также сильно варьируют показатели линейной регрессии (отрезки различаются в несколько раз, при этом значения наклона сравнимы).

Возможным объяснением этому факту могут быть субъективные отличия в проведении анализа между лабораториями, использовавшими в работе анализаторы и наборы Immulite. При этом если учитывать только результаты, полученные в ЛЭ (левая диаграмма), при достаточно высоком уровне корреляции можно утверждать, что по качеству определения концентрации кортизола в сыворотке крови тест-системы Immulite и Алкор Био не различаются. Данные по определению концентрации контролей Bio-Rad подтверждают объективность полученных результатов (см. Табл.1).

Таблица 1. Концентрации различных аналитов в контрольных сыворотках Lyphochek® Immunoassay Plus Control

Цветом выделено:

значения Алкор Био слегка ниже референсных

значения Алкор Био ниже референсных

значения Алкор Био выше референсных

Определение трийодтиронина и тироксина.

На рис. 2 представлены диаграммы, касающиеся определения трийодтиронина и тироксина. В нашей работе были доступны только сыворотки из лаборатории эндокринологии Научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, измеренные наборами фирмы Roche. Так как среди пациентов Центра практически нет больных с выраженной патологией щитовидной железы, в нашем распоряжении не было образцов с низкими или высокими концентрациями трийодтиронина и тироксина, поэтому группа значений имеет вид плотного скопления без видимой корреляции. Низкие коэффициенты корреляции не позволяют достоверно судить о характере зависимости между значениями, поэтому мы можем обсуждать качество анализа по совпадению диагноза, полученного тем или иным набором.

Из данных, представленных на рис.2 (границы норм наборов Roche и Алкор Био ограничены линиями) очевидно, что при определении трийодтиронина практически нет ситуаций (2 сыворотки, или 0.6%), когда в сыворотках, имеющих нормальное значение по Алкор Био, наборами Roche измеряются значения, соответствующие гипотиреозу и совсем нет нормальных по Алкор Био сывороток, соответствующих гипертиреозу Roche. Небольшое количество сывороток с заниженными (23 сыворотки, или 7%) или завышенными (7 сывороток, или 2%) значениями по Алкор Био соответствуют норме по Roche. Таким образом, за небольшим исключением (32 сыворотки, или 9%), значения трийодтиронина, полученные при определении наборами Алкор Био и Roche, соответствуют одному и тому же диагнозу.

В случае же определения тироксина существует определенная группа сывороток (35 сывороток, или 11%), нормальных по Алкор Био, которые при определении наборами Roche имеют значения, характерные для гипертиреоза.

Значения контролей Bio-Rad, измеренные наборами Алкор Био, попадают в диапазон представленных в Табл.2 значений и близки к средним значениям, за исключением 2 и 3 контроля в случае трийодтиронина (определенные значения Алкор Био в 1.5-2 раза выше средних и не соответствуют значениям Bio-Rad, декларируемым для Roche Cobas Core).

Из вышеизложенного следует, что для дальнейшего изучения качества наборов для определения трийодтиронина и тироксина необходимо исследовать когорту сывороток с низкими и высокими концентрациями этих гормонов, чтобы достоверно оценить степень и характер зависимости между значениями, полученными с использованием вышеуказанных наборов.

Определение тестостерона и прогестерона.

На рис. 3 представлены результаты сравнения значений концентрации прогестерона, полученных на наборах Алкор Био и DPC (Immulite), Алкор Био и Bayer (ACS:180) соответственно, на рис. 4 – то же для значений концентрации тестостерона.

Первым очевидным выводом является высокий уровень корреляции между значениями Алкор Био и Bayer, которой не наблюдается (в случае тестостерона) со значениями DPC. Что касается характеристики имеющейся зависимости, то и угол наклона регрессионной прямой ближе к 1.0, и отрезок ближе к 0 в случае Алкор Био/Bayer. Таким образом, в случае определения прогестерона и тестостерона ближе всего значения, полученные наборами Алкор Био и Bayer, а относительно значений DPC, значения Алкор Био имеют тенденцию к занижению (и прогестерон, и тестостерон) и меньшую корреляцию (тестостерон).

Одним из возможных объяснений низкой корреляции между значениями Алкор Био и DPC (например, при определении тестостерона) могут быть различия в принципах, положенных в основу наборов для количественного определения тех или иных аналитов у этих двух производителей и различия в матрицах калибраторов и контрольных материалов.

При определении концентрации тестостерона наборами Алкор Био в контролях Bio-Rad наблюдается занижение для контрольных сывороток 1-го уровня относительно данных, приведенных для набора сравнения (см. Табл.1), остальные контрольные сыворотки попадают в предписанный диапазон значений. В случае же прогестерона контрольная сыворотка 1-го уровня имеет заниженное значение, а два других – завышенные, при этом они не попадают в предписанный диапазон значений (см. Табл.1). Эти данные не согласуются с низкими значениями наклона регрессионной кривой между Алкор Био и DPC (Bayer), что может свидетельствовать также в пользу различий в определении тестостерона и прогестерона в контрольных сыворотках между тест-системами. Возможно, здесь играет роль вклад матрикс-эффекта искусственно приготовленных контрольных сывороток, который может быть различен при проведении анализа разными системами (подробнее см. ниже).

Определение хорионического гонадотропина (ХГч), пролактина и a-фетопротеина (АФП).

При определении концентрации пролактина (рис.5) имеется довольно высокий коэффициент корреляции для построения линейной регрессии и характер этой регрессии таков, что в нижней части калибровочной кривой значения Алкор Био имеют тенденцию к завышению относительно значений Roche, а в верхней части – к занижению (низкий угол наклона регрессионной кривой и большой отрезок).

Определенные наборами Алкор Био концентрации пролактина в контролях Bio-Rad сходны с табличными данными набора сравнения (см. Табл.1), хотя и немного выше средних значений. Тем не менее, это не противоречит результатам, изложенным выше, поскольку значения всех трех контрольных сывороток входят в нижнюю часть калибровочной кривой.

Значения концентраций ХГч имеют тенденцию к лучшей корреляции в паре Алкор Био/Bayer, нежели Алкор Био/Roche (рис.6). Также в первом случае бóльшая степень совпадений, характеризующаяся близким к 1.0 углом наклона и меньшим отрезком. При этом опять наблюдается некоторая несогласованность этих результатов с результатами измерения контрольных сывороток Bio-Rad, имеющих по Алкор Био завышенные значения, не попадающие в диапазон значений, представленных в таблице 1 (за исключением контроля 1-го уровня). Это также может объясняться влиянием матрикс-эффекта искусственно приготовленных контрольных сывороток Bio-Rad.

Сравнивая значения АФП, измеренные тремя наборами (рис.7), с высокой степенью достоверности можно заключить, что точность определения концентрации этого аналита совпадает у исследованных тест-систем – попарно Алкор Био/Roche и Алкор Био/DPC (Immulite).

Значения контролей Bio-Rad, измеренные набором Алкор Био попадают в спектр значений и близки к средним значениям для наборов Roche Cobas Core, однако сильно завышены относительно концентраций АФП, измеренных в системе Immulite2000 и даже не попадают в их спектр. Значения контролей при определении и системой Roche, и Immulite сходны между собой (за исключением 3-го уровня). Учитывая тот факт, что значения концентраций АФП, измеренные всеми тремя наборами реагентов, хорошо согласуются, это несоответствие может служить хорошей иллюстрацией нашего предположения о влиянии матрикс-эффекта на определение концентраций аналитов в контрольных сыворотках Bio-Rad.

Матрикс-эффект – это «помехи», привносимые в анализ различными компонентами биологического материала, присутствующими в реакционной смеси. Источником матрикс-эффекта является сложная и вариабельная смесь белков, углеводов, жиров, небольших молекул и солей, присутствующих в анализируемом образце (10-12). В нашем случае речь идет об искусственно приготовленных контрольных сыворотках Lyphochek^® Immunoassay Plus Control, которые производятся на основе сыворотки крови человека с добавлением компонентов человеческого происхождения, чистых химических реактивов и терапевтических препаратов. При этом в таком «коктейле» могут содержаться вещества, которые одновременно не встречаются в реальной сыворотке крови людей. Также, сыворотки 1-го уровня должны быть лишены ряда компонентов, присущих нормальным сывороткам крови человека, так как в них содержатся минимальные концентрации всех исследуемых аналитов. Таким образом, контрольные сыворотки могут служить потенциальным источником матрикс-эффекта, обусловливающего отличия в распознавании аналита в контрольной сыворотке и сыворотках крови людей, которые являются объектом исследования. Такое предположение косвенно подтверждается широким разбросом концентраций одного и того же аналита, измеренных в различных лабораториях (и, соответственно, разными наборами реагентов) (6).

Принимая во внимание высокую воспроизводимость этих значений при определении одним и тем же набором реагентов, их успешно можно использовать для внутрилабораторного и межлабораторного контроля качества работы конкретного набора.

Определение лютеинизирующего (ЛГ), фолликулостимулирующего (ФСГ) и тиреотропного (ТТГ) гормонов.

На рис.8-10 представлены результаты, полученные при измерении концентраций трех вышеперечисленных гормонов. С большой достоверностью можно говорить о хорошей корреляции между тремя наборами и высокой степени совпадений между ними. При этом можно отметить, что степень совпадений при определении ЛГ выше в паре Алкор Био/Roche, а при определении ФСГ – в паре Алкор Био/ Bayer, хотя в остальных случаях она тоже достаточно высока. Концентрации ЛГ, ФСГ и ТТГ в контролях Bio-Rad полностью соответствуют табличным значениям.

Заключение

Рассматривая картину полученных в данной работе результатов в целом, можно утверждать, что существует согласованность и корреляция между измеряемыми концентрациями аналитов в сыворотках крови людей при определении их четырьмя разными способами с использованием коммерчески доступных наборов реагентов разных фирм-производителей. При этом лучшая степень совпадений наблюдается в паре Алкор Био/Bayer, следующей по сходству значений является пара Алкор Био/Roche, и несколько хуже обстоят дела при сравнении Алкор Био/DPC.

Тот факт, что данные, полученные в разных лабораториях с использованием системы фирмы DPC – автоматического анализатора Immulite (в частности, при измерении кортизола), различны при сравнении их с данными Алкор Био, может послужить поводом к дальнейшей разработке проблемы согласованности работы клинических лабораторий. Это ставит перед нами новые исследовательские задачи (сравнение одних и тех же сывороток крови в разных лабораториях, изучение причин подобных флуктуаций и пр.).

Однако по результатам этой предварительной работы категоричные выводы делать пока невозможно. Для того, чтобы с полной уверенностью рассуждать о сходстве или отличиях в определении концентраций аналитов теми или иными тест-системами, необходимо устранить возможные вариации, возникающие при проведении анализов в разных лабораториях, более того – в разных городах, что неминуемо связано с замораживанием/размораживанием образцов, их транспортировкой и пр. Исходя из этого, предполагается провести подобный анализ в пределах одной лаборатории, определяя концентрации аналитов в одних и тех же образцах сывороток одновременно с использованием разных тест-систем, без замораживания в период между проведением отдельных анализов.

Таким образом, даже по предварительным результатам проведенного анализа данных можно с уверенностью сделать вывод о том, что значения концентраций аналитов, полученные с использованием 4-х исследованных тест-систем, согласуются между собой с высокой степенью достоверности. Это свидетельствует о том, что данные системы могут успешно применяться в практике лабораторной диагностики с одинаковым уровнем информативности и надежности.

Список литературы

1. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В. и др. Биометрия: Учебное пособие. – Ленинград, 1982.

2. Инструкции к наборам реагентов Алкор Био.

3. Инструкции к наборам реагентов для автоматического анализатора ACS:180^® (Automated Chemiluminescence System) © Bayer Corporation. All rights reserved.

4. Инструкции к наборам реагентов для автоматического анализатора Immulite^®.

5. Инструкции к наборам реагентов для автоматического анализатора Roche Cobas^® Core.

6. Инструкции к сывороткам Lyphochek^® Immunoassay Plus Control © All rights reserved. Printed in USA.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия. – М., 1990.

8. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. – М., 2000.

9. Теория и практика иммуноферментного анализа / Под ред. А.М. Егорова, А.П. Осипова, Б.Б. Дзантиева и др.– Москва, 1991.

10. Buttner J. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. – 1991. – N 205. – P. 11–20.

11. Selby C. // Ann. Clin. Biochem. – 1991. – N 36. – P. 704–721.

12. Wood W.G. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. – 1991. – N 205. – P. 105–112.