Совершенствование нанопорового секвенирования

24.05.201321140

Привлекательность персонализированного подхода к лечению и диагностике различных заболеваний человека сделала разработку новых, более эффективных, методов секвенирования ДНК одной из главных задач современных исследований в области генетики. Один из многообещающих подходов к секвенированию заключается в прочтении последовательности ДНК с помощью измерения напряжения электрического тока, меняющегося по мере проникновения нуклеотидов через наноскопическую пору.

Исследовательская команда под руководством физиков из Университета Пенсильвании (University of Pennsylvania, США) использовала твердотельные нанопоры для различения одноцепочечных молекул ДНК, содержащих последовательности, состоящие из одного повторяющегося основания.

Новый метод секвенирования подразумевает перемещение цепочек ДНК в солевом растворе под действием электрического поля через поры в особой мембране. Поскольку каждое основание проходит через пору, это препятствует одновременному прохождению через нее нескольких ионов. Усилители, присоединенные к нанопоровому чипу, регистрируют результирующее падение электрического напряжения. Так как каждое основание имеет определенный размер, исследователи надеются с помощью этого определить последовательность оснований в проходящей цепочке ДНК. Главная сложность заключается в том, что различия между размерами оснований слишком малы, поэтому необходимо тщательно соблюсти соотношение размеров нанопор и мембран к размеру молекулы ДНК.

Нанопоровые устройства, являющиеся коммерчески приемлемыми приборами для секвенирования, производятся из белковых пор и липидных мембран. При этом белковые поры имеют необходимые размеры, но липидные двухслойные мембраны, в которые помещены белки, не долговечны и не достаточно надежны.

Твердотельные нанопорные устройства, сделанные из тонких твердотельных мембран, по сравнению со своими биологическими аналогами, обладают очевидными преимуществами: их легче поставить на рынок и интегрировать с другими электронными устройствами. Однако они продемонстрировали более низкую чувствительность к различным основаниям ДНК.

«В то время как биологические нанопоры продемонстрировали способность определять одиночные нуклеотиды, развитие альтернативных твердотельных мембран запаздывало из-за двух главных трудностей, обусловленных производством пор правильного размера и достижением высокого сигнала с низким уровнем шума и высокой пропускной способностью измерений», – говорит руководитель исследования Мария Дрндич (Marija Drndić), доцент кафедры физики и астрономии в Школе Искусств и Наук (School of Arts and Sciences, США). По ее словам, в новом исследовании они попытались разрешить эти две проблемы.

Поскольку важнейшим свойством нанопоры, критичным для различения разных типов оснований, является размер отверстия поры, которая блокируется проходящим через нее основанием, то чем меньше диаметр поры, тем выше точность измерения. Чтобы повысить эффективность определения последовательностей оснований, размер нанопор должен быть приближен к размеру ДНК, а их толщина должна соответствовать пространству между основаниями, то есть составлять около 0,3 нм.

Для того чтобы получить твердотельные нанопоры и тончайшие мембраны, ученые, включая исследовательскую группу Дрндич, изучили самые современные материалы, в частности, графен. Графеновые мембраны содержат один слой атомов углерода в гексагональной решетке. Их толщина может быть всего около 0,5 нм. Но графен имеет определенные недостатки, в частности, он является гидрофобным материалом, что затрудняет прохождение через него нитей ДНК.

Дрндич и ее коллеги работали с другим материалом – нитридом кремния. Обработанный нитрид кремния, как показали результаты других исследований, проведенных в течение последнего десятилетия, – гидрофильный материал, пропускающий молекулы ДНК. И хотя такая мембрана получается толще, чем графеновая – около 5 нм – способ изготовления пор в нитриде кремния позволяет получить мембрану, не уступающую по толщине графеновой.

По словам Дрндич, способ, посредством которого ученые получают нанопоры в нитриде кремния, делает их постепенно сужающимися, поэтому эффективная толщина составляет приблизительно одну треть остальной части мембраны.

Дрндич и ее коллеги протестировали полученные в нитриде кремния нанопоры на гомополимерах – одноцепочечных последовательностях ДНК, состоящих только из одного основания, повторяющегося несколько раз. Ученые провели измерения для трех из четырех существующих оснований: аденина, цитозина и тимина. Они не пробовали протестировать гуаниновые основания, так как гуаниновые гомополимеры могут самогибридизоваться, что затрудняет их прохождение через нанопоры.

«Мы показали, что поры чувствительны к типу основания, – говорит Дрндич. – Мы наблюдали эти результаты на порах с диаметром от 1 до 2 нм, что предполагает возможность небольшого варьирования размера пор при производстве мембран».

Результаты исследования были опубликованы в журнале ACS Nano.

Иллюстрация гомополимера одноцепочечной ДНК, проходящего через нанопору в нитридe кремния. (фото: Image courtesy of University of Pennsylvania)

По материалам University of Pennsylvania

Оригинальная статья:

Kimberly Venta, Gabriel Shemer, Matthew Puster, Julio A. Rodríguez-Manzo, Adrian Balan, Jacob K. Rosenstein, Ken Shepard, Marija Drndić. Differentiation of Short, Single-Stranded DNA Homopolymers in Solid-State Nanopores. ACS Nano, 2013; : 130506122521006 DOI: 10.1021/nn4014388 


Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей