НОВАЯ НАУЧНО-ИНЖЕНЕРНАЯ ПЛАТФОРМА «НОВОБИО»

Новая научно-инженерная платформа «НовоБио» для исследования и оптимизации роста клеток и синтеза продуктов

Кураков В.В., Клыков С.П.,
ООО «Фарм-Регион», Москва,
pharm-region@mail.ru
smlk03@mail.ru
Краткие биографии авторов и краткое описание платформы «НовоБио» представлены здесь: http://fermenter.ru/forum/viewtopic.php?id=23

В данном кратком сообщении мы попытаемся подробнее развить тему оптимизации биосинтезов, а также наших более ранних статей на этом сайте [10,11]. В работе даны ссылки на интернет-публикации по современному мировому состоянию вопроса моделирования роста клеток и биосинтеза продуктов.

Судя по бурной реакции, выражающейся в сотнях просмотров нескольких наших сообщений на сайтах www.cbio.ru и www.fermenter.ru, содержащих некоторое, очень небольшое количество информации о наших предложениях, можно констатировать, что к проблеме моделирования роста популяций клеток и синтеза продуктов имеется немалый интерес. Однако многие коллеги, увидев математические символы и довольно скудные объяснения «физики вопросов», возможно, приходят в состояние, подобное сонливости. Просмотрев бегло какую-то работу по моделированию, они быстро о ней забывают, т.к., по их мнению, в практической деятельности это мало чего даст или не даст вообще ничего.

Это мнение ошибочно, потому как, если адекватная модель обладает эвристическими (прогностическими) свойствами, то она не то, что может, она должна (!) использоваться в качестве инструмента исследования. На научной стадии, при проработке таких моделей, их ценность заключается в том, что можно исследовать сами эти модели аналитически, а также их следствия, не прибегая к многочисленным дорогостоящим экспериментам. Достаточно проверить(ять) только какие-то ключевые моменты таких новых моделей и/или их следствий. Ценность моделей с простым и ясным физическим смыслом параметров , в отличие от статистических и полиномиальных, заключается в том, что они могут после проверки легко использоваться в практической деятельности. Модели, прошедшие такие проверки, принимают часто статус законов и переходят из разряда чисто научных исследований в сугубо практический инженерный инструмент управления технологией биосинтеза.

Наши интересы в биотехнологии лежат в области математического моделирования роста
микроорганизмов и синтеза клеточных продуктов в закрытых системах Для представляемых моделей не обнаружено исключений, и они позволяют оптимизировать все известные периодические процессы роста и биосинтеза. Рисунки, подтверждающие этот факт, приведены ниже. Достаточно хорошо можно видеть прекрасное качество описания нашими моделями совершенно разных процессов.

Технологическая биоинженерная платформа «НовоБио» включает следующие разделы:

1) Неструктурированная модель роста популяций клеток [1]. Эта модель позволяет рассчитать затраты энергетического субстрата на рост, поддержание жизнедеятельности микроорганизмов, долю недоокисленного субстрата, коэффициент массопередачи кислорода, максимальную биомассу для данной скорости массопередачи кислорода, требуемые профили скорости подачи энергетического субстрата, профили выделения углекислоты, параметры структурированной модели.

2) Структурированная модель роста популяций клеток [2-4]. Эта модель позволяет рассчитать структуру растущей популяции клеток, которую определяют делящиеся клетки X^div всех фаз клеточного цикла (принимается в расчётах как одно целое) и покоящиеся (стабильные) клетки, X^st. Покоящиеся клетки для бактерий известны в литературе, как находящиеся в фазе «B» клеточного цикла, а для эукариотов - как клетки в фазах «G₀» и «G₁».Основной показатель структурирования, использующийся во всех дальнейших расчётах, обозначается как R и равен отношению X^st/X. Данная модель позволяет рассчитать скорость накопления покоящихся клеток, время окончания всех клеточных делений в популяции, т.е., фактическое требуемое время окончания ферментации, t_{конечное}.

3) Модель оборота веществ [3,4]. Позволяет рассчитать синтез и утилизацию любых веществ, которые используются популяциями при культивировании, а также предсказывать пути оптимизации этих процессов. Расчёты проводятся при использовании некоторых уравнений структурированной и неструктурированной моделей.

4) Ноу-хау «Балансировка питательных сред, приготовленных на основе сложноорганических субстратов и гидролизатов натуральных продуктов для культивирования микроорганизмов и грибов и синтеза продуктов их жизнедеятельности». Подробнее содержание этого раздела, разработанного в середине 90-ых гг. нашим коллегой и партнёром доктором Дербышевым В.В., а также описанные выше модели, представлено здесь: [10,11].

5) Структурированные модели биомассы с комбинированием заданных возрастных и физиологических параметров. Данная проблема находится в разработке и подготовке к публикации.

По позициям 1-3 и 5 важно отметить, что все они взаимосвязаны и резких границ между ними нет. Каждая из этих составляющих плавно может быть переведена в любую иную, а параметры одной модели одновременно могут являться параметрами других. Т.е., границы являются условными и обозначены только для простоты обращения с моделями, как инструментами при проведении анализов процессов и их планировании.

Несколько особо можно выделить позицию 4, основанную на экспериментальных исследованиях питательных сред в колбах, с последующим анализом материалов согласно модели Моно и др, а затем планированием процессов культивирования на оптимизированных по п.4 средах согласно моделям «НовоБио».

В мире многие исследователи занимаются моделированием клеточного цикла, роста культур клеток, биосинтезов и для иных целей. Например, подборка для клеток млекопитающих:

http://orion.math.iastate.edu/boushaba/preprints/FB_GC_KB.pdf
http://www.math.canterbury.ac.nz/~b.basse/cell.pdf
http://cancerres.aacrjournals.org/content/69/12/5234.full
http://www.math.ualberta.ca/~thillen/paper/Act-Onc-final.pdf
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/vcell/mathematics/A%20mathematical%20model%20of%20the%20cell%20cycle%20of%20a%20hybridoma%20cell%20line.pdf
http://www.math.u-bordeaux1.fr/~adimy/modlmc/pdf/AdimyAnguloCrauste2007.pdf
http://www.math.uiowa.edu/~ayati/pubs/MMS06.pdf
http://www.molbiolcell.org/cgi/reprint/15/9/4105.pdf
http://jn.nutrition.org/content/132/4/674.full.pdf
http://www.medicine.mcgill.ca/physio/mackeylab/pdf_pub/bj_cfse_final.pdf
http://www.tuharburg.de/ibb/Research/PublicationsZeng/2007%20Liu%20A%20Population%20Balance%20Model%20Describing%20the%20Cell%20Cycle%20Dynamics%20of%20Myeloma%20Cell%20Cultivation.pdf
http://www-rocq.inria.fr/bang/JC/ClaiMichPerthECMTB05RevFinal.pdf
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.a.21023/pdf
http://jcb.rupress.org/content/144/5/977.full.pdf
http://digitalcommons.trinity.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1008&context=math_faculty
http://ukpmc.ac.uk/articles/PMC2749512/reload=0;jsessionid=A9342704050A34332EF8AD44A9D7925E.jvm4
http://www.biolsci.org/v07p0700.pdf
http://mcb.berkeley.edu/courses/mcb230/WEB/PAPERS/G1check.pdf

Или ссылка для бактерий (взаимодействия компонентов клеток и клеток):
http://celldynamics.org/celldynamics/research/pdfs/AlbertsOdell04.pdf

Все эти модели чрезвычайно сложны и вряд ли могут широко использоваться на заводах и в исследовательской практике. Наша платформа гораздо более проста и применима ко всем указанным случаям. Недостатки имеющихся моделей вызвали необходимость построения простых, но универсальных моделей, что, в свою очередь, позволило нам перейти к оптимизации процессов роста микроорганизмов и синтеза ими полезных продуктов.

Первоначальные работы по моделированию были выполнены при работе с патогенными микроорганизмами: Yersinia, Pseudomonas, Pasteurella, Salmonella (см. Рис.1 и 2). Структурированная и неструктурированная модели были созданы во время выполнения этих работ. Были получены интересные предсказания для структуры биомассы (Рис. 2.). Исследования первоначальных данных по синтезу пенициллина (Рис. 4,5) позволили создать общие модели для всех таких процессов.

Работы были выполнены на базе российских НИИ. Некоторые работы по увеличению выхода антибиотиков, в частности - грамицидина С, сделаны на заводе ОАО Красфарма (Красноярск). Последняя работа в виде полупромышленной технологии была приобретена одним из заводов в Европейском Союзе в конце 2008 г. Была получена и испытана в 10 балансовых операциях технология, дающая концентрации антибиотика, которая соответствует диапазону физиологически возможной максимальной концентрации для этого штамма с использованием предложенной Заказчику питательной среды, что в разы превышало первоначальные значения продуктивности.

Весьма интересна работа американских авторов , опубликованная в феврале 2011 г., в которой впервые после наших более ранних публикаций (1996, 2003, 2009 гг.) представлены экспериментальные данные, в которых показано влияние на биосинтез делящихся и покоящихся клеток.: http://www.ploscompbiol.org/article/info:doi%2F10.1371%2Fjournal.pcbi.1001077#aff2 . Это
показано на последнем рисунке в этой работе: http://www.ploscompbiol.org/article/slideshow.action?uri=info:doi/10.1371/journal.pcbi.1001077&imageURI=info:doi/10.1371/journal.pcbi.1001077.g004 .

Данные американских авторов полностью соответствуют предсказаниям нашей теории для закрытых систем. Сравните с результатами на Рис. 2 для сальмонелл, данные которого получены ещё в 1994-95 гг. Мы подтверждаем это информацией, содержащейся и на других рисунках, которые представлены ниже и описывают динамики роста биомассы для различных микроорганизмов, измеренные экспериментально и рассчитанные по нашей модели. Соответствующие динамики биосинтеза продуктов также представлены. Все эти динамики соответствуют совершенно различным видам микроорганизмов и классам продуктов и рассчитаны для опубликованных данных.

У нас есть богатый опыт собственных экспериментальных работ. Этот опыт подтверждает все наши тезисы, используемые в «НовоБио». Наш опыт применения данной теории позволяет увеличивать эффективность биологических синтезов не на проценты, а на десятки процентов и в разы. Мы предлагаем сотрудничество (кооперацию) в области оптимизации процессов микробиологического или клеточного синтеза. Представляемые Вашему вниманию модели до сих пор не были известны в биотехнологии и в биофизике. Если внимательно разобраться , то придётся признать, что данная платформа заключает в себе совершенно новые парадигмы в биофизике и, поэтому, мы были бы признательны Вам за внимательное и деловое рассмотрение данного предложения. Подробнее можно ознакомиться в печатных работах из представленного ниже списка литературы.

[lib]fig_01.jpg[/lib]
Рис. 1. Зависимость биомассы Salmonella, X*10⁹ клеток/мл, и покоящихся клеток Salmonella, X^st*10⁹ клеток/мл, от времени культивирования. Ось абсцисс – время в часах, ось ординат - X и X^st*10⁹ клеток/мл (тест: заморозка/разморозка для определения X^st). Эксперимент и модель [2].

[lib]fig_02.jpg[/lib]
Рис. 2. Согласно структурированной модели, R = X^st/X – доля покоящихся клеток, 1-R = (X-X^st)/X – доля делящихся клеток бактерий рода Salmonella [5]. LGP (logarithmic growth phase) – экспоненциальная или логарифмическая фаза роста культуры; GIP (growth inhibition phase) – фаза ингибирования роста культуры. Модель [2].

[lib]fig_03.jpg[/lib]
Рис. 3. Исходные данные по биомассе бактерий рода Halobacterium, X, штамм D96N, клетки в возрасте 0, X^st, и синтез пигмента бактериородопсина. Данные получены с использованием описанных моделей. Ось абсцисс – время роста в днях. Ось ординат 1 - X и X^st, грамм/л. Ось ординат 2 – концентрация бактериородопсина, P, мг/л (работа с галобактериями и бактериородопсином выполнена совместно с доктором Складневым Д.А.). Чёрными маркерами показана концентрация биомассы в граммах сухого веса на литр; экспериментальные данные. График 1 – концентрация биомассы в граммах сухого веса на литр, построен согласно неструктурированной модели. График 2 – клетки возраста 0, X^st в граммах сухого веса на литр, построен согласно структурированной модели [5]. График 3 – концентрация бактериородопсина в мг сухого веса на литр, построен согласно структурированной модели [5] (зелёными маркерами отмечены концентрации бактериородопсина; экспериментальные данные). Участок графика 3, отмеченный цифрой 4 – концентрация бактериородопсина в мг сухого веса на литр согласно структурированной модели [5]. Для вычисления концентраций бактериородопсина в последний период фазы LGP культуры использованы параметры фазы GIP [9]. Копия рисунка из американской статьи 2011 г. (приводится с любезного разрешения доктора Дж. Тайсона),указанной выше, для сравнения с Рис. 2: http://www.ploscompbiol.org/article/info:doi%2F10.1371%2Fjournal.pcbi.1001077#aff2

[lib]fig_04.jpg[/lib]
Рис. 4. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий рода Penicillium и Actinomyces [5].

[lib]fig_05.jpg[/lib]
Рис. 5. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу пенициллина [5].

[lib]fig_06.jpg[/lib]
Рис. 6. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий рода Chlorella [3,4].

[lib]fig_07.jpg[/lib]
Рис. 7. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу новобиоцина [3,4].

[lib]fig_08.jpg[/lib]
Рис. 8. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий рода Bacillus brevis [3,4].

[lib]fig_09.jpg[/lib]
Рис. 9. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу грамицидина С [3,4].

[lib]fig_010.jpg[/lib]
Рис. 10. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий вида Streptomyces hydroscopicus [3,4].

[lib]fig_011.jpg[/lib]
Рис. 11. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу туримицина [3,4].

[lib]fig_012.jpg[/lib]
Рис. 12. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий вида Alcaligenes eutrophus [3,4].

[lib]fig_013.jpg[/lib]
Рис. 13. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу полиоксибутирата [3,4].

[lib]fig_014.jpg[/lib]
Рис. 14. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий вида Zymomonas mobilis [3,4].

[lib]fig_015.jpg[/lib]
Рис. 15. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу левана и этанола [3,4].

[lib]fig_016.jpg[/lib]
Рис. 16. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по потреблению фосфора для роста биомассы Actinomyces [3,4].

[lib]fig_017.jpg[/lib]
Рис. 17. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по росту биомассы бактерий вида Clostridium acetobutilicum [3,4].

[lib]fig_018.jpg[/lib]
Рис. 18. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по синтезу ацетата и бутирата [3,4].

[lib]fig_019.jpg[/lib]
Рис. 19. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по потреблению азота для роста биомассы Actinomyces [3,4].

[lib]fig_020.jpg[/lib]
Рис. 20. Исходные и рассчитанные согласно модели данные по потреблению глюкозы для роста биомассы Actinomyces [3,4].


Список литературы:

1. Derbyshev V.V.,Klykov S.P.,Glukhov N.N.,Scherbakov G.Ja. The development populations in conditions of limitation by the energy supply// Biotekhnologia.-2001.-№2-с.89-96.

2. S.P.Klykov, Paderin J.P., Sadikov M.M., Chuprunov V.P., Derbyshev V.V., Gusev V.V. Effect of culture growth rate on Salmonella survival // Biotekhnologia-1996-1-p.35-39.

3. Klykov S.P., Derbyshev V.V. Relationship between biomass age structure and cell synthesis.-М.: Sputnik + Company, 2003.-48 p.

4. Derbyshev V.V., Klykov S.P. A technique for cultivation of cell biomass and biosynthesis target products with specified technological parameters.- Patent of Russian Federation #2228352, 2003.

5. S.P.Klykov, V.V. Derbyshev Dependence of cell population age structure, substrate utilization and metabolite synthesis on energy consumption // Biotekhnologia-2009-5-p.80-89.

6. Klykov S.P., Glukhov N.N., Nozdrin V.N., Tchernobrovkin Ju.B., Katkova L.N., Micevich Je.V., Авторское свидетельство СССР #333152 (секретно),1991.

7. Derbyshev V.V., Glukhov N.N., Klykov S.P., Nabokova A.P., Scherbakov G.Ja., Патент РФ #2111246 , СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ АЭРОБНОРАСТУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ.

8. Derbyshev V.V., Klykov S.P., Kuzmich M.K. , Тезисы доклада на Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" и международной специализированной выставки "Мир биотехнологии' 2003".

9. Dmitry A. Skladnev, Vladimir V.Kurakov , Sergey P. Klykov, THE ASSESSMENT OF BACTERIORHODOPSIN ACCUMULATION AND RATES OF ITS BIOSYNTHESIS BY INDUSTRIALLY SIGNIFICANT Halobacterium salinarum STRAINS ACCORDING TO A MODEL OF POPULATION STRUCTURING, Russian Bavarian Conference on Bio-Medical Engineering (the RBC-2010), 8-12th November, Moscow, 2010.

10. http://www.cbio.ru/modules/news/article.php?storyid=2218

11. http://www.cbio.ru/modules/news/article.php?storyid=2489