Векторы в генотерапии рака: преимущество спор клостридий перед вирусами

25.04.200883250
Солидные (твердые) опухоли составляют почти 90% всех онкологических заболеваний. Одним из потенциально перспективных способов лечения таких опухолей является генотерапия. Наиболее эффективные методики генотерапии основаны на доставке в пораженные клетки больного терапевтических генов с помощью вирусов, называемых вирусными векторами. К сожалению, такой способ лечения раковых опухолей обладает несколькими серьезными недостатками. Во-первых, для достижения значимого эффекта необходимо вводить их непосредственно внутрь опухоли, что значительно ограничивает область их применения, поскольку многие новообразования формируются и образуют метастазы в органах, недоступных для инъекционного введения вирусов. Во-вторых, злокачественные опухоли содержат как раковые клетки, так и здоровые, т.е. они характеризуются гетерогенностью, препятствующей вирусному инфицированию всех раковых клеток опухоли. В-третьих, полноценному функционированию и воспроизводству вирусов в зараженных клетках препятствует гипоксия (недостаток кислорода), свойственная большинству солидных опухолей. Вследствие этого часть раковых клеток опухоли остается неинфицированной терапевтическими вирусами, что приводит к ее возрождению.

Ранее было показано, что анаэробные бактерии способны селективно колонизировать твердые опухоли при их систематической доставке в опухоль. К таким бактериям относятся спорообразующие клостридии. Споры клостридий можно использовать как удобную систему доставки генетического материала в пораженные клетки, поскольку их легко получать и хранить; они устойчивы к внешним воздействиям и обладают онколитическим действием (способностью разрушать опухоли). Исследования, проведенные на животных и человеке, показали, что деградация опухоли почти во всех случаях происходит только внутри самой опухоли, не затрагивая той ее части, которая находится на границе со здоровыми тканями, хорошо снабжаемых кровью и кислородом. Споры клостридий, содержащие собственные противоопухолевые белковые факторы, можно дополнительно трансфецировать онколитическими генами. На моделях солидных опухолей животных было продемонстрировано, что комбинация трансгенных спор клостридий с традиционной химио- или лучевой терапией значительно повышает эффективность лечения.

Споры клостридий обладают значительным преимуществом перед вирусными векторами в терапии солидных опухолей. Однако, перед тем как использовать споры клостридий в клинической практике, необходимо убедиться в том, что они воздействуют исключительно на злокачественные новообразования, не затрагивая здоровых тканей, и способны уничтожать как первичные опухоли, так и метастазы. Современные технологии позволяют удовлетворить этим требованиям.

Введение

Генотерапия - лечение заболеваний человека с помощью введения специальных терапевтических генетических конструкций в пораженные клетки организма, - развивается в последнее время в ускоренном темпе и может оказаться эффективным методом лечения онкологических заболеваний (1). К концу 2006 года число клинически протестированных протоколов для генотерапии различных видов рака достигло 854, что составило 66,6 % от общего количества клинических испытаний различных заболеваний с помощью генотерапии (2). Это отражает тот факт, что онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в странах Запада (3).

Эффективность генотерапии определяется, прежде всего, системой доставки терапевтического генетического материала – так называемой векторной системой. Известные векторные системы принято подразделять на вирусные и невирусные. К настоящему времени именно вирусные векторы, обладающие онколитическим действием и способные к самовоспроизведению (репликационно-компетентные), зарекомендовали себя как наиболее перспективные инструменты генотерапии рака (4,5). Однако такая методика лечения злокачественных новообразований имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью введения вирусов непосредственно внутрь опухоли, не всегда возможного из-за ее локализации или наличия метастазов. Большая часть известных вирусных векторов не обеспечивает инфицирования всех раковых клеток опухоли, что приводит к рецидивам (6). Несмотря на то, что многие вирусные векторы демонстрируют терапевтическое действие в тканях опухолей, изолированных у онкологических больных, пока не удалось получить достоверного подтверждения их клинической эффективности.

Солидные опухоли составляют 90% всех онкологических заболеваний. Все солидные опухоли объединяет общее свойство: по достижении ими 2 мм в диаметре, начинается ангиогенез – формирование новых кровеносных сосудов, питающих опухоль. Этот процесс индуцируется изменениями в микроокружении раковых клеток, такими как формирование неполноценных сосудов, появление участков гипоксии и возникновение гетерогенной популяции злокачественных клеток (7). Такое микроокружение благоприятно для роста анаэробных бактерий вида Clostridia. Клостридии - облигатные анаэробы, способные расти только при отсутствии кислорода в среде. Они обладают несколькими преимуществами перед другими бактериями, поскольку споры клостридий могут избирательно заселять участки твердых опухолей, подверженные гипоксии, прорастать в жизнеспособные клетки и размножаться, вызывая разрушение опухоли. Предварительные клинические испытания продемонстрировали безопасность для здоровья человека ряда непатогенных штаммов клостридий. Однако клостридии обладают одним недостатком в качестве способа лечения солидных опухолей. Как показали многочисленные эксперименты, практически во всех случаях онколизис прекращался на внешних границах опухолей, что объясняется неспособностью клостридий существовать в обогащенных кислородом участках опухолей, находящихся на границе со здоровыми тканями. По этой причине успешное лечение солидных опухолей с помощью клостридий возможно только в сочетании с другими методами, такими как химио- или радиочастотная терапия (8,9). Недавние эксперименты с непатогенными штаммами C. Novyi в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, включая винорельбин (vinorelbin) и доксетаксел (docetaxel), продемонстрировали высокую онколитическую активность. В настоящее время эта методика терапии проходит фазу I клинических испытаний (10).

Способность клостридий к селективной колонизации опухолей открывает широкие возможности для их использования в качестве векторов в генотерапии рака. Лечение солидных опухолей с помощью комбинации методов генотерапии спорами клостридий, несущих гены, которые кодируют белки с различным противораковым действием (11,12,13), и химио- или лучевой терапии дает лучшие результаты, чем терапия спорами клостридий без дополнительного генетического материала, вызывающего противораковый эффект (12).

Ниже представлен обзор известных вирусных систем, включающих вектора направленного действия, репликационно-дефектные (не способные к воспроизведению) вектора и репликационно-компетентные онколитические вирусы. Рассмотрены преимущества и недостатки их использования в генотерапии рака. Далее обсуждается разработка спор клостридий в качестве векторов для переноса терапевтического генетического материала, механизмы их действия, а также их преимущества и недостатки по сравнению с вирусными векторами.

Разработка и использование вирусных векторных систем для генотерапии рака

(А) Ретровирусные векторные системы

Одной из первых систем генотерапии стал ретровирусный вектор, сконструированный на основе вируса мышиного лейкоза Molonеy (MoMLV).

Ретровирусы – это РНК-содержащие вирусы, заражающие клетки путем слияния мембран вируса и клетки-мишени, с последующим образованием двунитевого ДНК-генома (провируса) по матрице вирусной РНК с помощью вирусного фермента - обратной транскриптазы. Формирование новых вирусных частиц происходит при усиленной наработке РНК-копий вирусного ДНК-генома в ядре клетки-хозяина и синтезе вирусных белков в цитоплазме клетки с последующим отпочковыванием готовых вирусных частиц, сопровождающимся гибелью клетки-хозяина.

Этот вектор обладает уникальной способностью инфицировать делящиеся клетки (14). ДНК-провирус MoMLV способен интегрироваться в геном делящихся клеток и передаваться по наследству вместе с клеточным геномом. Раковые клетки быстро растут и постоянно делятся, как, например, клетки глиомы - одной из наиболее распространенных опухолей мозга. Эксперименты по генотерапии модели глиомы на животных с помощью вектора на основе вируса MoMLV продемонстрировали низкую инфицируемость раковых клеток, что является распространенной проблемой в экспериментах in vivo. Вирусные векторы MoMLV оказались не способными охватывать весь объем опухоли (15). Для повышения эффективности этой вирусной системы разработали репликационно-компетентный вариант вирусного вектора MoMLV, способный к воспроизводству в инфицированных клетках (16). Однократное внутричерепное введение репликационно-компетентного варианта вирусного вектора MoMLV в ксенографты глиомы человека у мышей приводило к распространению этого вируса далеко за пределы места инъекции, затрагивая только раковые клетки: в здоровых тканях мышей вирусы не обнаружились (16).

В целом, клинические испытания с помощью векторных систем на основе вируса MoMLV составляют более 23% от клинических испытаний всех систем генотерапии различных заболеваний человека. Эксперименты на мышах не выявили значимого токсического эффекта, вызываемого этими вирусами. Несмотря на это, ретровирусные системы представляют потенциальную опасность для здоровья человека, поскольку способны активировать онкогены и блокировать опухолевые супрессорные гены в инфицированных клетках. К сожалению, онкогенный эффект ретровируса был подтвержден клинически: после инфицирования терапевтическим вектором MoMLV стволовых клеток костного мозга детей, страдающих тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (Severe Combine Immunodeficiency Disease - SCID) – тяжелым заболеванием, часто приводящим у гибели детей грудного и младшего возраста, у 4 из 11 детей развилась лейкемия (17). Для внедрения этих векторов в клиническую практику требуется провести дополнительные исследования, направленные на повышение их безопасности и на улучшение инфицирующей способности вирусов, необходимой для уничтожения максимального количества раковых клеток в солидных опухолях.

Лентивирусы относятся к ретровирусам и характеризуются более длительным инкубационным периодом. Терапевтическим преимуществом векторов на основе лентивирусов, по сравнению с ретровирусными векторами, является их способность переносить длинные фрагменты генетической информации в геном инфицируемой клетки. Эти вектора основаны преимущественно на вирусах иммунодефицита человека (ВИЧ) и быка, и обладают всеми уникальными характеристиками вирусного вектора MoMLV, а также способностью переносить гены в постмитотические клетки in vitro и in vivo (18). Несмотря на подтверждение эффективного переноса генов в раковые клетки на моделях солидных опухолей с помощью векторов на основе ВИЧ, терапевтическое использование этих векторов вызывает опасения, поскольку ВИЧ является серьезным патогеном человека. Однако в настоящее время проводятся клинические испытания лентивирусных векторов, направленные на оценку безопасности их применения в терапии СПИДа (19). Более безопасными считаются вектора на основе лентивирусов быка. Одним из примеров таких векторов служит безопасный для человека вирус болезни Йембрана JDV (Jembrana Disease Virus), поражающий определенные виды крупного рогатого скота в округе Йембрана на острове Бали в Индонезии (20, 21). Вирус JDV обладает теми же преимуществами в качестве вектора, что и ВИЧ: он способен интенсивно размножаться и интегрироваться в хромосомы не пролиферирующих клеток.

(Б) Аденовирусные векторы

Одной из наиболее хорошо изученных и широко используемых систем доставки терапевтических генов в раковые клетки человека являются вектора на основе аденовирусов (АВ, adenoviral vector - AV). Они особенно полезны в тех случаях, когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена. Аденовирусы способны к воспроизводству в больших количествах и характеризуются эффективным переносом генов в различные типы раковых клеток (22). Два варианта векторов на основе аденовирусов были одобрены в Китае для клинического применения (23).

Кроме этого, несколько векторов на основе собачьих, свиных, овечьих, бычьих и птичьих аденовирусов было разработано для генотерапии раков человека. Один из таких векторов продемонстрировал терапевтическую эффективность на модели рака простаты у животных (24).

Основной проблемой, возникающей при разработке аденовирусных векторов для терапии рака, является недостаточная инфицирующая способность вирусов. В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на повышение прицельности и терапевтической эффективности рекомбинантных аденовирусных векторов (25).

(В) Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов

Вектора на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ, аdeno-associated virus - AAV) не вызывают токсического эффекта и проявляют высокую инфицирующую способность, как показывают доклинические испытания нескольких таких вирусов (26). На моделях глиомы у грызунов было продемонстрировано, что ААВ, кодирующий рецептор фактора роста сосудого эндотелия VEGF (vascular endothelial growth factor), способен блокировать рост опухолей. Несмотря на высокую эффективность ААВ, технология их получения и очитки представляет собой достаточно сложный и дорогостоящий процесс (27).

(Г) Векторы на основе вирусов герпеса

Благодаря высокой эффективности и не сложной методике получения, векторы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди разработчиков векторных систем. В настоящее время со многими вариантами терапевтических векторов на основе вирусов герпеса проводятся клинические испытания. Как в случае векторов на основе других вирусов, терапевтический интерес представляют только репликационно-компетентные штаммы вирусов герпеса. Первый вектор такого рода был создан на основе мутантного вируса герпеса с дефектным геном r34.5, отвечающим за нейротоксичность вируса. Инактивация гена r34.5 ограничила способность вируса к размножению в клетках центральной нервной системы и блокировала возможность его существования в латентной форме. Однако позже обнаружилось, что отсутствие активности гена r34.5 значительно снизило способность мутантного вируса к воспроизводству в раковых клетках (28).

Терапевтические возможности векторов на основе вирусов герпеса могут существенно ограничиваться наличием к нему иммунитета у пациентов. Иммунный ответ организма предотвращает перенос вирусами терапевтических генов к периферическим органам и вызывает гепатотоксичность. Однако некоторые мутантные штаммы вирусов герпеса продемонстрировали успешное лечение рака печени в модели на мышах, обусловленное, как предполагают ученые, непосредственным вирусным онколизисом и активностью специфических эффекторных клеток иммунной системы (29).

(Д) Вирусные векторы направленного действия

Основной проблемой, связанной с генотерапией вирусными векторами, остается низкая эффективность адресной доставки генов в раковые клетки. На пути к клетке-мишени вирус сталкивается с физическим препятствием – эндотелиальной стенкой сосудов. В качестве одного из способов решения этой проблемы был разработан аденовирусный вектор, нацеленный на рецепторный механизм трансцитоза (прохождения сквозь клетки эндотелиалия) с помощью специальных адаптерных молекул (32). Подвергшиеся трансцитозу вирусные частицы сохраняли способность заражать клетки, но эффективность транспорта вирусов сквозь клетки оставалась низкой. В настоящее время разрабатываются аденовирусные вектора, содержащие как сигнальные молекулы, направляющие вирусы на трансцитоз, так и молекулы, опосредующие связывание и заражение раковых клеток, находящихся «по ту сторону» стенки сосудов (33).

(Е) Мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов

Концепция мультифункциональных частиц (МФЧ) на основе вирусных векторов возникла относительно недавно. Она направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций: адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки, давали возможность их визуализации в организме и обладали бы прогрессирующим онколитическим действием. В качестве примера МФЧ на основе вирусного вектора можно привести ААВ с модифицированными белковыми «шипами», находящимися на оболочке вируса (с помощью шипов вирус взаимодействует с клеткой-мишенью). Изменения позволили одновременно «нацеливать» вирусы на раковые клетки и визуализировать передвижение, воспроизведение и распространение ААВ. Взаимодействие тимидин-киназы ТК ВПГ, находящейся на поверхности модифицированного ААВ, с известным субстратом для позитронной эмиссионной томографии (Positron Emission Tomography, PET) 18F-пенцикловиром (18F-penciclovir) позволяет проводить мониторинг вирусных частиц в клинической практике. Кроме этого, фермент ТК ВПГ открывает возможности для так называемой суицидной генотерапии, суть которой заключается в следующем: фермент ТК преобразует свои субстраты (такие лекарства, как ганцикловир) в метаболиты, узнаваемые ферментами зараженной клетки. Последовательное воздействие клеточных белков на эти метаболиты приводит к образованию токсичного конечного продукта, вызывающего гибель клетки (34). Интересно, что продукция ТК ВПГ инфицированной опухолевой клеткой индуцирует самоуничтожение смежных клеток, в чем проявляется одно из свойств МФЧ – прогрессирующее онколитическое действие.

Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов (35). Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.

Механизмы генотерапии с помощью вирусных векторов

(А) Коррекционное добавление гена

Все онкологические заболевания принято подразделять на p53-зависимые и p53-независимые, поскольку большинство случаев заболевания раком опосредовано мутациями в гене p53. Белок p53 представляет собой известный опухолевый супрессор, основная функция которого заключается в поддержании стабильности генома. Он принимает участие в регуляции клеточного цикла, в исправлении возникающих дефектов ДНК и в апоптозе – запрограммированной клеточной гибели . Воздействие на клетку факторов, вызывающих изменения в структуре ДНК, таких как ультрафиолетовое излучение, ионизирующая радиация и различные химические вещества, приводит к активации белка p53, который индуцирует либо арест клеточного цикла, необходимый для исправления возникших дефектов ДНК (репарацию), либо запускает механизм апоптоза. По этой причине мутации в гене p53 могут приводить к неконтролируемой клеточной пролиферации и к мутагенезу, опосредуя возникновение и прогрессию злокачественного новообразования.

Доклинические испытания показали, что замена мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии, приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток(36,37).

Клинические испытания ретровирусных и аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены p53, оказались эффективными в замене дефектных генов p53 у пациентов, страдающих немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ, non small cell lung cancer - NSCLC) и бронхоальвеолярной карциномой (38,39,40). К сожалению, в клинических испытаниях не удалось обнаружить значительного терапевтического эффекта даже при совместном применении аденовирусных векторов, рекомбинантных по гену p53 дикого типа, и химиотерапии (41).

(Б) Суицидная генотерапия

Суть суицидной генотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует пролекарство в лекарство - «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток. Ярким примером суицидного фермента является тимидинкиназа (ТК) вируса простого герпеса (ВПГ) (herpes simplex virus - HSV). ТК ВПГ преобразует нетоксичные аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир или ацикловир, в токсичные вещества, приводящие к гибели клеток. Наподобие описанной выше методики аденовирусного переноса гена p53, доклинические испытания аденовирусного вектора AdHSV TK (adenoviral HSV TK), кодирующего ТК ВПГ, продемонстрировали гибель не только инфицированных, но и смежных с ними клеток при систематическом введении ганцикловира. Эффект объясняется как воздействием токсинов, высвобождаемых зараженными клетками, на соседние клетки, так и ответом иммунной системы на инфекцию (42).

Клинические испытания AdHSV TK, который вводили в плевральную полость больным мезотелиомой плевры, продемонстрировали успешный перенос тимидинкиназы у большей части пациентов, при этом у нескольких больных опухоли частично сократились (43).

Основной проблемой, препятствующей применению этой стратегии в клинической практике, является низкая эффективность доставки терапевтических генов.

(В) Иммуно-генотерапия

Еще один механизм генотерапии злокачественных новообразований основан на индукции иммунного ответа организма, направленного на разрушение опухолей. В отличие от коррекционной замены гена и суицидной генотерапии, иммунная генотерапия обладает теоретическим преимуществом, поскольку кроме временного воздействия на опухоль иммунной системы, возможен пролонгированный противоопухолевый эффект, связанный с иммунологической памятью. Такая методика особенно полезна для элиминации метастазов, обнаруживаемых в разных органах и системах организма.

Фаза I доклинических испытаний лечения НМРЛ аутологичными опухоль-инфильтрующими лимфоцитами (ОИЛ) (tumour infiltrating lymphocyte - TIL), модифицированными геном интерлейкина-2 (IL-2) с помощью аденовирусных векторов, выявила значительную регрессию опухолей у испытуемых. Интерлейкины обеспечивают передачу сигналов между клетками иммунной системы, а IL-2 усиливает активность ОИЛ. В ходе испытаний ОИЛ изолировали из злокачественного плеврального экссудата, взятого у больных НМРЛ, генетически модифицировали их с помощью аденовирусного вектора, несущего ген IL-2, и вводили пациентам измененные ОИЛ в плевральную полость, после чего обнаружили сокращение новообразований.

Другой подход, используемый в доклинических исследованиях, основан на генетическом модифицировании дендритных клеток с помощью гена, кодирующего интерлейкин-7 (IL-7). Белок IL-7 стимулирует цитотоксический иммунный ответ и снижает выработку опухолевыми клетками трансформирующего фактора роста TGF-beta (transforming growth factor), обладающего иммуносупрессивным действием. Введение внутрь опухолей дендритных клеток, модифицированных АВ AdIL-7, содержащим ген IL-7, привело к регрессии опухолей и формированию иммунной памяти у мышей, что демонстрирует значительные преимущества этой методики по сравнению с непосредственным введением в опухоли вирусных векторов AdIL-7. Аналогичный подход, основанный на генетической модификации дендритных клеток лентивирусной конструкцией продемонстрировал терапевтический эффект более, чем у 85% пациентов (46).

(Г) Генотерапия, направленная на подавление ангиогенеза

Злокачественные опухоли характеризуются усиленным ангиогенезом. Один из подходов генотерапии нацелен на подавление формирования кровеносных сосудов в раковых опухолях. Известно несколько ингибиторов ангиогенеза (например, ангиостатина (47) и эндостатина (48)), вызывающих регрессию опухолей посредством подавления образования кровеносных сосудов, как было продемонстрировано в моделях на животных. Опухолевый ангиогенез можно подавить также с помощью доставки в сосуды опухоли генов, продукты которых блокируют образование кровеносных сосудов.

Белок Raf необходим для ангиогенеза, поскольку мыши, нокаутные по гену, кодирующему Raf, погибали на ранних этапах развития из-за серьезных дефектов сосудов. Доставка мутантного гена Raf в опухоли мышей индуцировала апоптоз раковых эндотелиальных клеток и регрессию опухолей.

Эндотелиальные клетки растущих сосудов опухолей усиленно производят рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGF2, известный также как FLK-1). Белок VEGF2 (FLK-1) также может оказаться удачной мишенью генотерапии, направленной на подавление ангиогенеза (49).

(Д) Технология «молчащих» генов (сайленсинг генов)

Одна из новейших технологий в генотерапии рака направлена на сайленсинг (от англ. silence -молчание) генов, отвечающих за рост и деление раковых клеток. «Заглушить» гены можно, например, с помощью механизма РНК-интерференции, при котором связывание коротких двунитевых молекул РНК с регуляторной последовательностью гена-мишени вызывает остановку синтеза продукта этого гена. С помощью РНК-интерференции ученым удалось добиться сайленсинга гена, кодирующего рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor EGFR), что вызвало подавление роста клеток НМРЛ (50).

Споры клостридий специфически нацелены на раковые опухоли и доставляют в них терапевтические гены

Эффективная генотерапия рака станет возможной при получении такого вектора, который мог бы онколитически воздействовать как на саму опухоль, так и на ее метастазы, находящиеся в разных тканях организма. Этим требованиям удовлетворяют споры клостридий. Клостридии – строго анаэробные грамположительные бактерии, имеющие палочковидную форму, способные образовывать споры при неблагоприятных условиях. К настоящему времени насчитывается до 80 видов клостридий. Для роста всех видов клостридий необходимы анаэробные условия, но устойчивость этих бактерий к концентрации кислорода в среде варьирует от вида к виду. Внутривенное введение спор клостридий продемонстрировало значительное преимущество этого метода в лечении рака перед известными методами, поскольку споры клостридий достаточно легко получать и хранить. Прорастание спор происходит только в том случае, если они попадают в анаэробные условия. О способности клостридий к спонтанной колонизации опухолей у онкологических больных и об очевидной их нацеленности на опухоли было известно еще 50 лет назад. Первый эксперимент, проведенный в 1947 году, показал, что введение спор C. Histolyticum в саркому мыши вызвало онколизис и регерессию опухоли (51). Внутривенное введение мышам спор штамма C. tetani , вызывающего столбняк, привело в течение 48 часов к гибели мышей, имевших раковые опухоли, из-за колонизации опухолей бактериями C. tetani и развившегося столбняка. А введение спор C. tetani мышам, не имеющих злокачественных опухолей, никак не сказалось на их здоровье. Этот эксперимент доказал, что в анаэробных условиях, характерных для солидных опухолей, C. tetani способны селективно прорастать из спор и интенсивно размножаться, систематически выделяя токсины (52). Очевидно, что для лечения заболеваний человека нельзя использовать патогенные виды бактерий. Одним из первых непатогенных штаммов клостридий стал C. butyricum M-55, который впоследствии назвали C. oncolyticum, а затем – C. sporogene (ATCC13732). Этот штамм клостридий обладает онколитическим действием.

Внутривенное введение спор некоторых штаммов сахаролитических клостридий (сбраживающих преимущественно полисахариды или сахара) грызунам, имеющим раковые опухоли, вызывало колонизацию бактериями только обедненных кислородом участков опухолей, что приводило только к частичному онколизису (54, 55).

Первым генетически модифицированным штаммом клостридий стал C. sporogenes , в который ввели ген, кодирующий естественный антибиотик колицин E3 (Colicin E3) в E. Coli. Было показано, что колицин E3 обладает некоторым противораковым действием (56).

Следующий рекомбинантный штамм клостридий – C. sporogenes NCIMB10696 содержащит ген деаминазы цитозина CD (cytosine deaminase) из E. coli. Этот штамм клостридий эффективно колонизировал опухоли, но индуцировал только временный онколитический эффект по неизвестным причинам (57). Внутривенное введение спор различных штаммов клостридий вызывало колонизацию опухолей, оцениваемую в 108 КОЕ/г опухоли (колониеобразующих единиц -colony formation unit, CFU) (таблица).

Таблица. Противораковый эффект генетически модифицированных штаммов клостридий.



* CDEPT (clostridial-directed enzyme prodrug therapy) - терапия с помощью ферментов, доставленных клостридиями, и пролекарств.


Сахаролитические клостридии, включая штаммы C. beijerinckii ATCC17778, C. acetobutylicum DSM792 (ATCC824) или C. acetobutylicum NI4082 (реклассифицированный как C. saccharoperbutylacetonicum) и C. butyricum, не патогенны. Разработка этих штаммов для нужд генотерапии была профинансирована биотехнологическими компаниями. В эти штаммы вводили терапевтические гены, кодирующие TNF-alpha, CD и NTR, оценивали уровень продукции клостридиями рекомбинантных белков и анализировали противораковый эффект модифицированных спор (58,59). Однако тестирование C. acetobutylicum, модифицированного CD, на моделях солидных опухолей у животных не выявило значительного онколитического действия. Предположительно, низкая эффективность рекомбинантного штамма связана с недостаточной колонизацией опухолей клостридиями (60). Вектора на основе «суперколонизаторов» опухолей – штаммов клостридий C. sporogenes и C. novyi-NT, рекомбинантных по NTR, продемонстрировали значительный противоопухолевый эффект при их совместном использовании с пролекарством CB1954 (61) (см. таблицу). Этот эксперимент свидетельствует о значительном клиническом потенциале векторов на основе спор клостридий.

Преимущества векторов на основе спор клостридий для генотерапии рака

В настоящее время разрабатываются различные векторные системы для генотерапии рака. Однако ни один из имеющихся на сегодняшний день векторов не является в достаточной степени эффективным в терапии рака, что связано, преимущественно, со сложным патогенезом солидных опухолей. Вектора на основе спор клостридий вызвали повторную волну интереса по приведенным ниже причинам.

Безопасность

Вирусные вектора далеко не безопасны для человека, поскольку:
(1) они могут продуцировать токсичные вирусные белки и вызывать сильный иммунный ответ (62);
(2) уменьшение иммунногенности трансгена приводит к снижению эффективности терапии (63);
(3) вирусные частицы могут поражать не только опухоли, но и здоровые ткани.
Векторы на основе спор клостридий представляются более безопасными, чем вирусные системы. Клостридии строго анаэробны и не способны существовать вне опухолей. Эксперименты с C. novyi-NT показали, что эти бактерии не заселяли ткани в области искусственно смоделированного инфаркта сердца, видимо из-за того, что уровень гипоксии в этих тканях был ниже, чем в тканях солидных опухолей. Даже в случае побочных эффектов, от клостридий легко избавиться с помощью антибиотиков. Например, применение метронидазола позволяет полностью уничтожить споры клостридий в крови больных за 9 дней (64).

Микросреда опухолей благоприятна для роста клостридий

Уникальная микросреда солидных опухолей является препятствием для воспроизводства вирусов (65, 66). Гипоксия, характерная для злокачественных опухолей, может значительно снижать способность вирусов к заражению раковых клеток и подавлять воспроизводство вирусов в таких клетках, что приводит к значительному снижению эффективности вирусной генотерапии. Кроме клеток, подверженных гипоксии, серьезное препятствие для вирусов представляют апоптотические и покоящиеся клетки (67). Напротив, такие ниши благоприятны для прорастания и размножения спор клостридий. Споры клостридий дикого типа и генетически модифицированных штаммов способны специфично колонизировать и элиминировать солидные опухоли.

Споры клостридий легко производить

Для производства вирусных векторов необходимы сложные системы клеточных культур, дорогие питательные среды, последовательные этапы фильтрации, очистки и центрифугирования, а также особые условия хранения. Технология получения спор клостридий из культур анаэробных бактерий достаточно проста и не требует значительных капиталовложений. К тому же, полученные споры клостридий можно хранить в течение 3-6 месяцев при комнатной температуре.

Споры клостридий легко направлять в опухоли

Большинство вирусных векторов необходимо вводить непосредственно внутрь опухоли для достижения значимого терапевтического эффекта, тогда как споры клостридий достаточно вводить внутривенно, поскольку они способны поступать в опухоль с кровотоком и прорастать там.

Клостридии воздействуют на все типы клеток в опухолях, включая стромальные и стволовые клетки

Солидные опухоли содержат не только раковые клетки, но также внеклеточный матрикс и не злокачественные клетки разных типов, включая стромальные и стволовые клетки, такие как фибробласты, эндотелиальные и клетки иммунной системы. Механизмы уничтожения опухолей с помощью векторов на основе спор клостридий включают два аспекта. Один из них, используемый также в генотерапии с помощью вирусных векторов, определяется трансгеном, который может кодировать как фермент, конвертирующий пролекарство в лекарство при суицидной генотерапии, так и цитокин для иммуногенотерапии. Другой аспект, характерный исключительно для анаэробных клостридий, связан с противоопухолевым действием бактериальных протеолитических ферментов, таких как протеазы, липазы и нуклеазы. Более того, клостридии и окружающие их клетки (включая раковые, стромальные и стволовые клетки) конкурируют за питательные вещества, и клостридии выигрывают в этой битве, поскольку делятся гораздо быстрее, чем клетки млекопитающих. Таким образом, клостридии провоцируют естественную гибель клеток опухоли, вызванную недостатком питательных веществ. Жизнедеятельность клостридий в опухоли активирует реакцию иммунной системы, усиливая противоопухолевый эффект этих бактерий (68). В совокупности, эти механизмы уничтожения опухолей приводят к разрушению не только самих раковых клеток, но и соседних клеток. В этом заключается преимущество векторов на основе спор клостридий перед вирусными векторами и другими традиционными методами лечения солидных опухолей.

Эффективность не зависит от внедрения вектора в клетку-мишень и не требуется интеграции трансгена в геном раковой клетки

Вирусным векторам необходимо проникнуть в раковую клетку, чтобы осуществить онколитическое действие путем интегрирования трансгена в геном клетки-хозяина и воспроизводства вирусных частиц в инфицированной клетке. С помощью вирусных векторов невозможно добиться заражения всех раковых клеток опухоли, что приводит к возрождению опухоли без применения дополнительных методов терапии, таких как химиотерапии или лучевой терапии. Споры клостридий проявляют свое противоопухолевое действие во внеклеточном пространстве, поскольку растут и делятся вне клеток; трансген так же экспрессируется во внеклеточном пространстве, поэтому не требуется интеграции гена в геном раковых клеток. Споры клостридий не обладают мутагенной активностью, в отличие от вирусных векторов.

Неограниченные возможности по переносу терапевтических генов

Размеры вирусного генома позволяют переносить только небольшие трансгены. А споры клостридий обладают практически неограниченными возможностями для генетических модификаций, поскольку новые гены можно вводить как в геном бактерий, так и в автономно воспроизводящиеся кольцевые ДНК - плазмиды.

Заключение

Уникальная патофизиология солидных опухолей представляет серьезную проблему для традиционной терапии, что и является основной причиной низкой эффективности лечения рака. На сегодняшний день проводятся интенсивные исследования, направленные на разработку новых подходов для лечения онкологических заболеваний, включая генотерапию с помощью вирусных векторов (69-71). Наиболее перспективными из них являются репликационно-компетентные варианты вирусов (2,3). К сожалению, вирусные системы имеют ряд недостатков, связанных с необходимостью введения вирусов во все раковые клетки опухоли, гипоксией, препятствующей нормальному функционированию вируса и инфицированных клеток, и сами вирусы могут выделять токсичные вещества. Из неинфицированных клеток опухоли обычно возрождаются.

Строго анаэробные клостридии способны селективно колонизировать солидные опухоли и демонстрируют высокую эффективность лечения модельных новообразований. В настоящее время проводится фаза I клинических испытаний с наиболее перспективным непатогенным штаммом клостридий C. novyi-NT (10). Одним из основных преимуществ спор клостридий является их способность прорастать только в раковых опухолях, включая метастазы, и не затрагивая других тканей организма. Споры клостридий обладают практически неограниченными возможностями по переносу трансгенов, что открывает широкие перспективы для разработок, направленных на повышение эффективности генотерапии.

Список литературы:

1. Woo CY, Osada T, Clay TM, Lyerly HK, Morse MA: Recent clinical progress in virus-based therapies for cancer. Expert Opin Biol Ther 2006, 6(11):1123-34.
2. Papanastassiou V, Rampling R, Fraser M, Petty R, Hadley D, Nicoll J, Harland J, Mabbs R, Brown M: The potential for efficacy of the modified (ICP 34.5(-)) herpes simplex virus HSV1716 following intratumoural injection into human malignant glioma: a proof of principle study. Gene Ther 2002, 9:398-406.
3. Pipiya T, Sauthoff H, Huang YQ, Chang B, Cheng J, Heitner S, Chen S, Rom WN, Hay JG: Hypoxia reduces adenoviral replication in cancer cells by downregulation of viral protein expression. Gene Ther 2005, 12(11):911-7.
4. Seth P: Vector-mediated cancer gene therapy: an overview. Cancer Biol Ther 2005, 4(5):512-7. Epub 2005
5. Colombo F, Barzon L, Franchin E, Pacenti M, Pinna V, Danieli D, Zanusso M, Palu G: Combined HSV-TK/IL-2 gene therapy in patients with recurrent glioblastoma multiforme: biological and clinical results. Cancer Gene Ther 2005, 12:835-848.
6. Clark WH: Tumor progression and the nature of cancer. Br J Cancer 1991, 64:631-644.
7. Vaupel P, Harrison L: Tumour hypoxia: causative factors, compensatory mechanisms, and cellular response. Oncologist 2004, 9:4-9.
8. Carey RW, Holland JF, Whang HY, Neter E, Bryant B: Clostridial oncolysis in man. Euro J Can 1967, 3:37-46.
9. Wei MQ, Ellem KA, Dunn P, West MJ, Bai CX, Vogelstein B: Facultative or obligate anaerobic bacteria have the potential for multimodality therapy of solid tumours. Eur J Cancer 2007, 43(3):490-6. Epub 2006 Nov 17
10. Website title [http://www.clinicaltrials.gov/ct]
11. Liu SC, Minton NP, Giaccia AJ, Brown JM: Anticancer efficacy of systemically delivered anaerobic bacteria as gene therapy vectors targeting tumor hypoxia/necrosis. Gene Ther 2002, 9(4):291-296.
12. Theys J, Landuyt W, Nuyts S, Van Mellaert L, van Oosterom A, Lambin P, Anne J: Specific targeting of cytosine deaminase to solid tumours by engineered Clostridium acetobutylicum. Cancer Gene Ther 2001, 8(4):294-7.
13. Ochsenbein AF: Immunological ignorance of solid tumors. Springer Seminars in Immunopathology 2005, 27:19-35.
14. Young LS, Searle PF, Onion D, Mautner V: Viral gene therapy strategies: from basic science to clinical application. J Pathol 2006, 208(2):299-318.
15. Ram Z, Culver KW, Oshiro EM, Viola JJ, DeVroom HL, Otto E, Long Z, Chiang Y, McGarrity GJ, Muul LM, Katz D, Blaese RM, Oldfield EH:
Therapy of malignant brain tumors by intratumoral implantation of retroviral vector-producing cells. Nat Med 1997, 3(12):1354-61.
16. Tai CK, Wang WJ, Chen TC, Kasahara N: Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther 2005, 12(5):842-51.
17. Buchholz CJ, Cichutek K: Is it going to be SIN?: a European Society of Gene Therapy commentary: Phasing-out the clinical use of non self-inactivating murine leukemia virus vectors: initiative on hold. J Gene Med 2006, 8(10):1274-6.
18. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D: In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 1996, 272(5259):263-7.
19. Levine BL, Humeau LM, Boyer J, MacGregor RR, Rebello T, Lu X, Binder GK, Slepushkin V, Lemiale F, Mascola JR, Bushman FD, Dropulic B, June CH: Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci USA 103(46):17372-7. 2006, Nov 14; Epub 2006 Nov 7.
20. Metharom P, Tayra S, Xia HQ, MacMillian J, Shepherd R, Wilcox G, Wei MQ: New bovine lentiviral vectors based on the Jembrana disease virus. J Gene Med 2000, 2(3):176-185.
21. Metharom P, Xia HQ, Takyar S, Wilcox G, Ellem K, Wei MQ: The development of bovine lentiviral vectors based on the Jembrana disease virus, an infectious agent of Cattle. Vet Microbiol 2000, 80(1):9-22.
22. Rein DT, Breidenbach M, Curiel DT: Current developments in adenovirus-based cancer gene therapy. Future Oncol 2006, 2(1):137-43.
23. Peng ZH: Current Status of Gendicine in China: Recombinant Human Ad-p53 Agent for Treatment of Cancers. Human Gene Ther 2005, 16(9):1016-1027.
24. Wang XY, Martiniello-Wilks R, Shaw JM, Ho T, Coulston N, Cooke-Yarborough C, Molloy PL, Cameron F, Moghaddam M, Lockett TJ, Webster LK, Smith IK, Both GW, Russell PJ: Preclinical evaluation of a prostate-targeted gene-directed enzyme prodrug therapy delivered by ovine atadenovirus. Gene Ther 2004, 11(21):1559-67.
25. Matthews QL, Sibley DA, Wu H, Li J, Stoff-Khalili MA, Waehler R, Mathis JM, Curiel DT: Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Mol Imaging 2006, 5(4):510-9.
26. Flotte TR: Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther 2004, 11(10):805-10.
27. Urabe M, Nakakura T, Xin KQ, Obara Y, Mizukami H, Kume A, Kotin RM, Ozawa K: Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol 2006, 80(4):1874-85.
28. Harland J, Dunn P, Cameron E, Conner J, Brown SM: The herpes simplex virus (HSV) protein ICP34.5 is a virion component that forms a DNA-binding complex with proliferating cell nuclear antigen and HSV replication proteins. J Neurovirol 2003, 9(4):477-88.
29. Derubertis BG, Stiles BM, Bhargava A, Gusani NJ, Hezel M, D'Angelica M, Fong Y: Cytokine-secreting herpes viral mutants effectively treat tumor in a murine metastatic colorectal liver model by oncolytic and T-cell-dependent mechanisms. Cancer Gene Ther 2007 in press.
30. Lee JS, Lee JH, Poo H, Kim MS, Lee SH, Sung MH, Kim CJ: Growth inhibitory effect of triple anti-tumor gene transfer using Semliki Forest virus vector in glioblastoma cells. Int J Oncol 2006, 28(3):649-54.
31. Izsvak Z, Ivics Z, Plasterk RH: Sleeping beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol 2000, 302:93-102.
32. Zhu ZB, Makhija SK, Lu B, Wang M, Rivera AA, Preuss M: Transport across a polarized monolayer of Caco-2 cells by transferring receptor-mediated adenovirus transcytosis. Virology 2004, 325:116-128.
33. McIntosh DP, Tan XY, Oh P, Schnitzer JE: Targeting endothelium and its dynamic caveolae for tissue-specific transcytosis in vivo: a pathway to overcome cell barriers to drug and gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:1996-2001.
34. Li J, Le LP, Sibley DA, Mathis JM, Curiel DT: Genetic incorporation of HSV-1 thymidine kinase into the adenovirus protein ix for functioal display on the virion. Virology 2005, 338:247-258.
35. Pankhurst QA, Connolly J, Jones SK, Dobson J: Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. J Phys D Appl Phys 2003, 36:R167-R181.
36. Fujiwara T, Cai DW, Georges RN, Mukhopadhyay T, Grimm EA, Roth JA: Therapeutic effect of a retroviral wild-type p53 expression vector in an orthotopic lung cancer model. J Natl Cancer Inst 1994, 86:1458-1462.
37. Zhang WW, Fang X, Mazur W, French BA, Georges RN, Roth JA: High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus. Cancer Gene Ther 1994, 1:5-13.
38. Roth JA, Nguyen D, Lawrence DD, Kemp BL, Carrasco CH, Ferson DZ, Hong WK, Komaki R, Lee JJ, Nesbitt JC, Pisters KM, Putnam JB, Schea R, Shin DM, Walsh GL, Dolormente MM, Han CI, Martin FD, Yen N, Xu K, Stephens LC, McDonnell TJ, Mukhopadhyay T, Cai D: Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer. Nat Med 1996, 2:985-991.
39. Schuler M, Rochlitz C, Horowitz JA, Schlegel J, Perruchoud AP, Kommoss F, Bolliger CT, Kauczor HU, Dalquen P, Fritz MA, Swanson S, Herrmann R, Huber C: A phase I study of adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer in patients with advanced nonsmall cell lung cancer. Hum Gene Ther 1998, 9(14):2075-2082.
40. Gahery-Segard H, Molinier-Frenkel V, Le Boulaire C, Saulnier P, Opolon P, Lengagne R, Gautier E, Le Cesne A, Zitvogel L, Venet A, Schatz C, Courtney M, Le Chevalier T, Tursz T, Guillet JG, Farace F: Phase 1 trial of recombinant adenovirus gene transfer in lung cancer. Longitudinal study of the immune responses to transgene and viral products. J Clin Invest 1997, 100:2218-2226.
41. Nemunaitis J, Swisher SG, Timmons T, Connors D, Mack M, Doerksen L, Weill D, Wait J, Lawrence DD, Kemp BL, Fossella F, Glisson BS, Hong WK, Khuri FR, Kurie JM, Lee JJ, Lee JS, Nguyen DM, Nesbitt JC, Perez-Soler R, Pisters KM, Putnam JB, Richli WR, Shin DM, Walsh GL, Merritt J, Roth J: Adenovirus-mediated p53 gene transfer in sequence with cisplatin to tumors of patients with non-smallcell lung cancer. J Clin Oncol 2000, 18:609-622.
42. Hwang HC, Smythe WR, Elshami AA, Kucharczuk JC, Amin KM, Williams JP, Litzky LA, Kaiser LR, Albelda SM: Gene therapy using adenovirus carrying the herpes simplex thymidine kinase gene to treat in vitro models of human malignant mesothelioma and lung cancer. Am J Respir Cell Mol Biol 1995, 13:7-16.
43. Sterman DH, Treat J, Litzky LA, Amin KM, Coonrod L, Molnar-Kimber K, Recio A, Knox L, Wilson JM, Albelda SM, Kaiser LR: Adenovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene delivery in patients with localized malignancy: results of a phase I clinical trial in malignant mesothelioma. Hum Gene Ther 1998, 9:1083-1092.
44. Liu CS, Kong BH, Xia HQ, Ellem KA, Wei MQ: VP22 enhanced intercellular trafficking of HSV thymidine kinase reduced the level of ganciclovir needed to cause suicide cell death. J Gene Med 2001, 3:145-152.
45. Schuler M, Herrmann R, De Greve JL, Stewart AK, Gatzemeier U, Stewart DJ, Laufman L, Gralla R, Kuball J, Buhl R, Heussel CP, Kommoss F, Perruchoud AP, Shepherd FA, Fritz MA, Horowitz JA, Huber C, Rochlitz C: Adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer in patients receiving chemotherapy for advanced nonsmall cell lung cancer; results of a multicenter phase II study. J Clin Oncol 2001, 19:1750-1758.
46. Metharom P, Ellem K, Schmidt C, Wei MQ: Lentiviral vectormediated tyrosinase-related protein-2 gene transfer to dentritic cells for the therapy of melanoma. Human Gene Ther 2001, 12(18):2203-2213.
47. O'Reilly MS, Holmgren L, Chen C, Folkman J: Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Med 1996, 2:689-692.
48. O'Reilly M: Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997, 88:277-285.
49. Niethammer AG, Xiang R, Becker JC, Wodrich H, Pertl U, Karsten G, Eliceiri BP, Reisfeld RA: A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med 2002, 8:1369-1375.
50. Zhang M, Zhang X, Bai CX, Chen J, Wei MQ: Inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) by RNA interference in A549 cells. Acta Pharmacol Sin 2004, 25(1):61-7.
51. Parker RC, Plummber HC, Siebenmann CO, Chapman MG: Effect of hispolyticus infection and toxin on transplantable mouse tumours. Proc Soc Exp Biol Med 1947, 66:461-465.
52. Malmgren RA, Flanigan CC: Localization of the vegetative form of Clostridium tetani in mouse tumors following intravenous spore administration. Cancer Res 1955, 15(7):473-8.
53. Mцse JR, Mцse GZ: Onkolyseversuche mit apathogen, anaerogen sporenbildern am Erhlich-Tumor der maus. Z Krebsforsch 1959, 63:63-74.
54. Lemmon MJ, van Zijl P, Fox ME, Mauchline ML, Giaccia AJ, Minton NP, Brown JM: Anaerobic bacteria as a gene delivery system that is controlled by the tumor microenvironment. Gene Ther 1997, 4:791-796.
55. Lambin P, Theys J, Landuyt W, Rijken P, van der Kogel A, van der Schueren E, Hodgkiss R, Fowler J, Nuyts S, de Bruijn E, Van Mellaert L, Annй J: Colonisation of Clostridium in the body is restricted to hypoxic and necrotic areas of tumours. Anaerobe 1998, 4:183-188.
56. Schlechte H, Elbe B: Recombinant plasmid DNA variation of Clostridium oncolyticum-model experiments of cancerostatic gene transfer. Zbl Bakt Hyg A 1988, 268(3):347-56.
57. Liu SC, Minton NP, Giaccia AJ, Brown JM: Anticancer efficacy of systemically delivered anaerobic bacteria as gene therapy vectors targeting tumor hypoxia/necrosis. Gene Ther 2002, 9(4):291-6.
58. Theys J, Landuyt AW, Nuyts S, Van Mellaert L, Lambin P, Annй J: Clostridium as a tumor-specific delivery system of therapeutic proteins. Cancer Detect Prev 2001, 25(6):548-57.
59. Van Mellaert L, Barbe S, Anne J: Clostridium spores as antitumour agents. Trends Microbiol 2006, 14(4):190-6.
60. Wei MQ, Mengesha A, Good D, Annй J: Bacterial targeted tumour therapy-dawn of a new era. Cancer Lett 259(1):16-27. 2008, Jan 18
61. Theys J, Pennington O, Dubois L, Anlezark G, Vaughan T, Mengesha A, Landuyt W, Ann J, Burke PJ, Durre P, Wouters BG, Minton NP, Lambin P: Repeated cycles of Clostridium-directed enzyme prodrug therapy result in sustained antitumour effects in vivo. Br J Cancer 2006, 95(9):1212-9.
62. Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivel NA, Bagg A, Gao GP, Wilson JM, Batshaw ML: Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab 2003, 80(1– 2):148-58.
63. Yang Y, Li Q, Ertl HC, Wilson JM: Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J Virol 1995, 69:2004-2015.
64. Nuyts S, Van Mellaert L, Theys J, Landuyt W, Lambin P, Ann J: Clostridium spores for tumor-specific drug delivery. Anticancer Drugs 2002, 13(2):115-25.
65. Folkman J: What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst 1990, 82:4-6.
66. Vaupel P, Mayer A: Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome. Cancer Metastasis Rev in press. 2007, Apr 18.
67. Hay JG: The potential impact of hypoxia on the success of oncolytic virotherapy. Curr Opin Mol Ther 2005, 7(4):353-8.
68. Janssen HL, Haustermans KM, Balm AJ, Begg AC: Hypoxia in head and neck cancer: how much, how important? Head Neck 2005, 27(7):622-38.
69. Agrawal N, Bettegowda C, Cheong I, et al.: Bacteriolytic therapy can generate a potent immune response against experimental tumors. Proc Nat Acad Sci 2004, 101:15172-15177.
70. Kasono K, Blackwell JL, Douglas JT, Dmitriev I, Strong TV, Reynolds P, Kropf DA, Carroll WR, Peters GE, Bucy RP, Curiel DT, Krasnykh V: Selective gene delivery to head and neck cancer cells via an integrin targeted adenoviral vector. Clin Cancer Res 1999, 5:2571-2579.
71. Huang Q, Zhang X, Wang H, Yan B, Kirkpatrick J, Dewhrist MW, Li CY: A novel conditionally replicative adenovirus vector targeting telomerase-positive tumor cells. Clin Cancer Res 2004, 10:1439-1445.
72. Marty C, Schwendener RA: Cytotoxic tumor targeting with scFv antibody-modified liposomes. Methods Mol Med 2005, 109:389-402.
73. Fox ME, Lemmon MJ, Mauchline ML, Davis TO, Giaccia AJ, Minton NP, Brown JM: Anaerobic bacteria as a delivery system for cancer gene therapy: in vitro activation of 5-fluorocytosine by genetically engineered clostridia. Gene Ther 1996,
3(2):173-8. Erratum in: Gene Ther 1996 Aug;3(8):741.

Подготовила Дарья Червякова.

Статья Ming Q Wei, Ruimei Ren, David Good и Jozef Ann «Clostridial spores as live 'Trojan horse' vectors for cancer gene therapy: comparison with viral delivery systems» опубликована 17 февраля 2008 г. в журнале [url=http://www.gvt-journal.com/content/6/1/8/]Genetic Vaccines and Therapy[/i] 2008, 6:8.

Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей