РНК-интерференция в терапии рака. Часть 3.
22.04.2011
2836
0
28360
РНК-интерференция и SNP
Использование специфических миРНК для подавления экспрессии мутантных аллелей генов также представляет основу для разработки методов лечения наследственных заболеваний человека, вызванных наличием генетических мутаций, приводящих к изменению функционирования клеток. Зачастую аллели, связанные с развитием заболевания, отличаются от нормальных аллелей генов только на 1 нуклеотид. Такие однонуклеотидные замены, приводящие к развитию патологических состояний, называются SNP (single nucleotide polymorphism). Для подавления экспрессии мутантных аллелей, отличающихся от нормальных на 1 нуклеотид, миРНК должны обладать способностью выявлять SNP и специфически связываться только с мутантными последовательностями. Первые исследования по изучению однонуклеотидных мутаций различных генов, таких как MTHFR (Haranatha, Reddy and Jamil, 2006), CYP3A4 (Suman and Jamil, 2006) и DPD (Kalyan and Jamil, 2007), относились к фармакогенетике, то есть были связаны с изучением индивидуальной чувствительности или устойчивости пациентов к противораковым препаратам.Эти исследования помогли понять основы фармакогенетики и выяснить, как точковые мутации влияют на предрасположенность пациентов к определенным заболеваниям. Следовательно, предполагается, что исследования онкологических заболеваний и метод посттрансляционного подавления экспрессии гена, то есть РНК-интерференция, являются важным шагом на пути сокращения частоты раковых заболеваний.
К онтогенезу относятся все события индивидуального развития организма от оплодотворения до смерти. В основе развития всех органов и тканей организма лежит четко определенный временной и пространственный характер экспрессии генов. Уникальный фенотип взрослого организма является результатом каскада множества транскрипционных событий, вызывающих экспрессию генов в определенных клетках. Специфический характер экспрессии генов может быть определен и для опухолевых клеток человека. Использование РНК-интерференции для анализа функций генов, особенно в сочетании с геномным анализом экспрессии генов, имеет огромный потенциал для выяснения биологических сигнальных путей и взаимодействий между ними. Хотя одни малые РНК обладают высокой специфичностью к гену-мишени, другие могут связываться и с нецелевыми последовательностями. Таким образом, по мере накопления знаний о малых РНК будут совершенствоваться и экспериментальные методы: первичной является разработка специфичных миРНК, после чего возможности РНК-интерференции можно будет использовать в полную силу.
Этапы разработки терапии, основанной на РНК-интерференции
Выбор молекулярной мишени
Несмотря на то, что эффективность миРНК была проверена в экспериментах на животных, перед внедрением техники РНК-интерференции в противораковую терапию необходима разработка и оценка работы метода на культуре раковых клеток человека. Первым шагом является выбор гена-мишени для РНК-интерференции. Генами-кандидатами могут быть уже описанные выше онкогены, антиапоптотические гены, гены ангиогенных факторов, факторов роста или их рецепторов, а также специфические гены, связанные с развитием рака, которые часто подвергаются мутациям. После выбора гена необходимо оптимизировать дизайн последовательности миРНК, используемой для подавления целевого гена. Для этой цели обычно используются компьютерные программы, выбирающие участок последовательности, отвечающий необходимым критериям. После синтеза 2-3 наиболее подходящих миРНК выбирается самая специфичная и эффективная последовательность, которая далее проходит валидацию в экспериментах in vitro для оценки уровня гибридизации с мРНК (связывания с целевой последовательностью мутантного гена).
Создание миРНК
На настоящий момент нет единого надежного метода создания идеальной терапевтической последовательности миРНК. Как правило, учитывается несколько параметров (Elbashir et al., 2002). Оптимальная схема создания структуры миРНК была разработана, исходя из биохимии процесса РНК-интерференции (Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003, Chiu and Rana, 2002, Reynolds et al., 2004, Ui-Tei et al., 2004) и функций молекулы мРНК. В настоящее время множество биотехнологических компаний, таких как Sigma, Dharmacon, QIAGEN и Ambion занимаются разработкой программного обеспечения для создания миРНК, а также предоставляют услуги по синтезу специфических миРНК.
Системы доставки миРНК в клетки
Для доставки миРНК внутрь клетки или целого организма можно использовать несколько разных методов, таких как электропорация (McRobert and McConkey, 2002), «пропитывание» миРНК (Malhotra et al., 2002), доставка с помощью бактерий, содержащих дцРНК (Caplen et al., 2001), трансфекция с использованием коммерческих реактивов (Elbashir et al., 2001) и векторные системы (Lois et al., 2002; Paddison et al., 2002). Хотя трансфекция с использованием коммерческих реактивов в настоящее время применяется наиболее широко (Kim, 2003), в последнее время все большее внимание уделяется векторным системам благодаря их высокому терапевтическому потенциалу. Векторные системы подразумевают использование либо ДНКовых, либо вирусных векторов. В первом случае промотеры РНК-полимеразы II или III встраиваются в ДНК-вектор перед экспрессионными «кассетами» миРНК (Brummelkamp et al., 2002a; Paddison et al., 2002; Sui et al., 2002; Xia et al., 2002). Эти кассеты включают в себя либо смысловые и антисмысловые последовательности миРНК, экспрессируемые с тандемных промотеров, либо малые РНК, образующие шпильки (Dykxhoorn et al., 2003). Использование промотеров РНК-полимеразы II для продукции малых РНК, образующих шпильки, имеет преимущества, так как позволяет легче адаптироваться к специфической экспрессии миРНК (Wall and Shi, 2003).
Плазмидные векторы
Более продолжительного подавления экспрессии гена можно достичь, вызывая в клетке экспрессию миРНК с использованием плазмидных векторов, содержащих специфические промотеры (Lee et al., 2001; Paul et al., 2002; Sui et al., 2002). Наиболее эффективным является использование плазмидной конструкции, экспрессирующей миРНК в виде коротких молекул-предшественников, имеющих форму шпилек (Paddison et al., 2002). Эти предшественники, экспрессируемые с промотеров РНК-полимеразы II или III, процессируются в полноценные миРНК с помощью белка Drosha. Малые РНК, образующие шпильки, имеют участок двуцепочечной последовательности РНК размером 19-29 пар нуклеотидов, который комплементарен целевой последовательности мРНК, и шпильку, состоящую из 6-9 нуклеотидов, которая в клетке удаляется белком Dicer для создания эффективной молекулы миРНК. Плазмидные векторы, экспрессирующие малые РНК, образующие шпильки, успешно используются для достижения стабильного и эффективного подавления экспрессии специфических генов (Dykxhoorn et al., 2003).
Промотер полимеразы III широко используется для инициации экспрессии малых РНК, образующих шпильки, так как он активен во всех типах клеток и эффективно управляет синтезом малых некодирующих транскриптов, схожих по структуре с малыми РНК, образующими шпильки, и несущих четко определенные концевые генетические последовательности. Промотер полимеразы II не обладает такими свойствами и потому редко используется для таких целей. Однако метод доставки миРНК с помощью плазмидных векторов имеет некоторые ограничения. Например, для трудно трансфецируемых клеток, таких как нейроны, клетки простейших и стволовые клетки, системы, экспрессирующие малые РНК, образующие шпильки, не подходят. Одним из способов решить эту проблему является доставка миРНК с использованием вирусной трансдукции.
Вирусные векторы
Аденовирусные и ретровирусные векторы доказали свою эффективность как системы доставки на многих типах клеток, включая стволовые клетки и зиготы (Abbas-Terki et al., 2002; Lois et al., 2002; Rubinson et al., 2003; Shen et al., 2003). Вирусные векторы подходят для более стабильной и продолжительной экспрессии малых РНК, образующих шпильки (Shen et al., 2003). Еще один процесс для достижения направленной доставки и высвобождения миРНК в раковые клетки подразумевает использование вирусов-бактериофагов наподобие phi29, использующих особый тип РНК (пРНК) для упаковки своей ДНК в белковую оболочку (Guo S et al; 2006). Молекулы пРНК работают как транспортное средство и могут связываться с миРНК, осуществляя ее доставку в клетки.
Наночастицы как система доставки миРНК
Недавно оказалось, что наночастицы являются идеальной системой доставки миРНК в клетку. Наночастицы можно создавать специфично к определенной молекуле РНК, а также специфично к определенным клеткам, что говорит о практически полном отсутствии риска связывания с нецелевыми клетками. Это свойство имеет особое значение в случае использования миРНК, так как существует мнение, что миРНК, доставленные в нецелевые клетки, могут вызвать непредсказуемые последствия.
Профессор Марк Дэвис (Mark Davis) из Калифорнийского Технологического Института (California Institute of Technology) и его коллеги разработали метод доставки наночастиц, содержащих специфические последовательности миРНК, в клетки больных меланомой. Анализ биопсий опухолей после проведенного экспериментального лечения выявил, что наночастицы, нагруженные миРНК, успешно ингибировали экспрессию ключевого опухолевого гена RRM2, чья работа необходима для деления раковых клеток. Ученые создали наночастицы из двух синтетических полимеров и белка, способного связываться с рецепторами на поверхности раковых клеток и со специфическими участками миРНК. Созданные наночастицы достигали около 70 нм в диаметре. Их получали путем смешения исходных компонентов (синтетических полимеров, белка и миРНК) в воде, где компоненты автономно собирались в функциональные наноструктуры. Полученные частицы были введены в кровоток пациентов, где циркулировали до попадания в «пропускающий» кровеносный сосуд, снабжающий кровью опухоль. Попав в опухоль, наночастицы связывались с рецепторами на поверхности опухолевых клеток и абсорбировались. Оказавшись внутри клетки, наночастицы распадались, высвобождая миРНК. Остальные компоненты наночастиц, безвредные для организма человека, метаболизировались в почках и выводились с мочой.
В основе еще одного способа доставки миРНК в раковые клетки лежит использование наночастиц, покрытых молекулами фолиевой кислоты – агента, связывающегося с рецепторами, имеющимися на поверхности большинства раковых клеток. Поверхность этих наночастиц содержит тиольную группу, серосодержащая часть которой связывается с серным элементом золотых наночастиц. Белок глутатион раковых клеток-мишеней замещается на тиольные группы наночастиц, приводя к высвобождению миРНК (Khaled et al., 2005).
Использование специфических миРНК для подавления экспрессии мутантных аллелей генов также представляет основу для разработки методов лечения наследственных заболеваний человека, вызванных наличием генетических мутаций, приводящих к изменению функционирования клеток. Зачастую аллели, связанные с развитием заболевания, отличаются от нормальных аллелей генов только на 1 нуклеотид. Такие однонуклеотидные замены, приводящие к развитию патологических состояний, называются SNP (single nucleotide polymorphism). Для подавления экспрессии мутантных аллелей, отличающихся от нормальных на 1 нуклеотид, миРНК должны обладать способностью выявлять SNP и специфически связываться только с мутантными последовательностями. Первые исследования по изучению однонуклеотидных мутаций различных генов, таких как MTHFR (Haranatha, Reddy and Jamil, 2006), CYP3A4 (Suman and Jamil, 2006) и DPD (Kalyan and Jamil, 2007), относились к фармакогенетике, то есть были связаны с изучением индивидуальной чувствительности или устойчивости пациентов к противораковым препаратам.Эти исследования помогли понять основы фармакогенетики и выяснить, как точковые мутации влияют на предрасположенность пациентов к определенным заболеваниям. Следовательно, предполагается, что исследования онкологических заболеваний и метод посттрансляционного подавления экспрессии гена, то есть РНК-интерференция, являются важным шагом на пути сокращения частоты раковых заболеваний.
К онтогенезу относятся все события индивидуального развития организма от оплодотворения до смерти. В основе развития всех органов и тканей организма лежит четко определенный временной и пространственный характер экспрессии генов. Уникальный фенотип взрослого организма является результатом каскада множества транскрипционных событий, вызывающих экспрессию генов в определенных клетках. Специфический характер экспрессии генов может быть определен и для опухолевых клеток человека. Использование РНК-интерференции для анализа функций генов, особенно в сочетании с геномным анализом экспрессии генов, имеет огромный потенциал для выяснения биологических сигнальных путей и взаимодействий между ними. Хотя одни малые РНК обладают высокой специфичностью к гену-мишени, другие могут связываться и с нецелевыми последовательностями. Таким образом, по мере накопления знаний о малых РНК будут совершенствоваться и экспериментальные методы: первичной является разработка специфичных миРНК, после чего возможности РНК-интерференции можно будет использовать в полную силу.
Этапы разработки терапии, основанной на РНК-интерференции
Выбор молекулярной мишени
Несмотря на то, что эффективность миРНК была проверена в экспериментах на животных, перед внедрением техники РНК-интерференции в противораковую терапию необходима разработка и оценка работы метода на культуре раковых клеток человека. Первым шагом является выбор гена-мишени для РНК-интерференции. Генами-кандидатами могут быть уже описанные выше онкогены, антиапоптотические гены, гены ангиогенных факторов, факторов роста или их рецепторов, а также специфические гены, связанные с развитием рака, которые часто подвергаются мутациям. После выбора гена необходимо оптимизировать дизайн последовательности миРНК, используемой для подавления целевого гена. Для этой цели обычно используются компьютерные программы, выбирающие участок последовательности, отвечающий необходимым критериям. После синтеза 2-3 наиболее подходящих миРНК выбирается самая специфичная и эффективная последовательность, которая далее проходит валидацию в экспериментах in vitro для оценки уровня гибридизации с мРНК (связывания с целевой последовательностью мутантного гена).
Создание миРНК
На настоящий момент нет единого надежного метода создания идеальной терапевтической последовательности миРНК. Как правило, учитывается несколько параметров (Elbashir et al., 2002). Оптимальная схема создания структуры миРНК была разработана, исходя из биохимии процесса РНК-интерференции (Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003, Chiu and Rana, 2002, Reynolds et al., 2004, Ui-Tei et al., 2004) и функций молекулы мРНК. В настоящее время множество биотехнологических компаний, таких как Sigma, Dharmacon, QIAGEN и Ambion занимаются разработкой программного обеспечения для создания миРНК, а также предоставляют услуги по синтезу специфических миРНК.
Системы доставки миРНК в клетки
Для доставки миРНК внутрь клетки или целого организма можно использовать несколько разных методов, таких как электропорация (McRobert and McConkey, 2002), «пропитывание» миРНК (Malhotra et al., 2002), доставка с помощью бактерий, содержащих дцРНК (Caplen et al., 2001), трансфекция с использованием коммерческих реактивов (Elbashir et al., 2001) и векторные системы (Lois et al., 2002; Paddison et al., 2002). Хотя трансфекция с использованием коммерческих реактивов в настоящее время применяется наиболее широко (Kim, 2003), в последнее время все большее внимание уделяется векторным системам благодаря их высокому терапевтическому потенциалу. Векторные системы подразумевают использование либо ДНКовых, либо вирусных векторов. В первом случае промотеры РНК-полимеразы II или III встраиваются в ДНК-вектор перед экспрессионными «кассетами» миРНК (Brummelkamp et al., 2002a; Paddison et al., 2002; Sui et al., 2002; Xia et al., 2002). Эти кассеты включают в себя либо смысловые и антисмысловые последовательности миРНК, экспрессируемые с тандемных промотеров, либо малые РНК, образующие шпильки (Dykxhoorn et al., 2003). Использование промотеров РНК-полимеразы II для продукции малых РНК, образующих шпильки, имеет преимущества, так как позволяет легче адаптироваться к специфической экспрессии миРНК (Wall and Shi, 2003).
Плазмидные векторы
Более продолжительного подавления экспрессии гена можно достичь, вызывая в клетке экспрессию миРНК с использованием плазмидных векторов, содержащих специфические промотеры (Lee et al., 2001; Paul et al., 2002; Sui et al., 2002). Наиболее эффективным является использование плазмидной конструкции, экспрессирующей миРНК в виде коротких молекул-предшественников, имеющих форму шпилек (Paddison et al., 2002). Эти предшественники, экспрессируемые с промотеров РНК-полимеразы II или III, процессируются в полноценные миРНК с помощью белка Drosha. Малые РНК, образующие шпильки, имеют участок двуцепочечной последовательности РНК размером 19-29 пар нуклеотидов, который комплементарен целевой последовательности мРНК, и шпильку, состоящую из 6-9 нуклеотидов, которая в клетке удаляется белком Dicer для создания эффективной молекулы миРНК. Плазмидные векторы, экспрессирующие малые РНК, образующие шпильки, успешно используются для достижения стабильного и эффективного подавления экспрессии специфических генов (Dykxhoorn et al., 2003).
Промотер полимеразы III широко используется для инициации экспрессии малых РНК, образующих шпильки, так как он активен во всех типах клеток и эффективно управляет синтезом малых некодирующих транскриптов, схожих по структуре с малыми РНК, образующими шпильки, и несущих четко определенные концевые генетические последовательности. Промотер полимеразы II не обладает такими свойствами и потому редко используется для таких целей. Однако метод доставки миРНК с помощью плазмидных векторов имеет некоторые ограничения. Например, для трудно трансфецируемых клеток, таких как нейроны, клетки простейших и стволовые клетки, системы, экспрессирующие малые РНК, образующие шпильки, не подходят. Одним из способов решить эту проблему является доставка миРНК с использованием вирусной трансдукции.
Вирусные векторы
Аденовирусные и ретровирусные векторы доказали свою эффективность как системы доставки на многих типах клеток, включая стволовые клетки и зиготы (Abbas-Terki et al., 2002; Lois et al., 2002; Rubinson et al., 2003; Shen et al., 2003). Вирусные векторы подходят для более стабильной и продолжительной экспрессии малых РНК, образующих шпильки (Shen et al., 2003). Еще один процесс для достижения направленной доставки и высвобождения миРНК в раковые клетки подразумевает использование вирусов-бактериофагов наподобие phi29, использующих особый тип РНК (пРНК) для упаковки своей ДНК в белковую оболочку (Guo S et al; 2006). Молекулы пРНК работают как транспортное средство и могут связываться с миРНК, осуществляя ее доставку в клетки.
Наночастицы как система доставки миРНК
Недавно оказалось, что наночастицы являются идеальной системой доставки миРНК в клетку. Наночастицы можно создавать специфично к определенной молекуле РНК, а также специфично к определенным клеткам, что говорит о практически полном отсутствии риска связывания с нецелевыми клетками. Это свойство имеет особое значение в случае использования миРНК, так как существует мнение, что миРНК, доставленные в нецелевые клетки, могут вызвать непредсказуемые последствия.
Профессор Марк Дэвис (Mark Davis) из Калифорнийского Технологического Института (California Institute of Technology) и его коллеги разработали метод доставки наночастиц, содержащих специфические последовательности миРНК, в клетки больных меланомой. Анализ биопсий опухолей после проведенного экспериментального лечения выявил, что наночастицы, нагруженные миРНК, успешно ингибировали экспрессию ключевого опухолевого гена RRM2, чья работа необходима для деления раковых клеток. Ученые создали наночастицы из двух синтетических полимеров и белка, способного связываться с рецепторами на поверхности раковых клеток и со специфическими участками миРНК. Созданные наночастицы достигали около 70 нм в диаметре. Их получали путем смешения исходных компонентов (синтетических полимеров, белка и миРНК) в воде, где компоненты автономно собирались в функциональные наноструктуры. Полученные частицы были введены в кровоток пациентов, где циркулировали до попадания в «пропускающий» кровеносный сосуд, снабжающий кровью опухоль. Попав в опухоль, наночастицы связывались с рецепторами на поверхности опухолевых клеток и абсорбировались. Оказавшись внутри клетки, наночастицы распадались, высвобождая миРНК. Остальные компоненты наночастиц, безвредные для организма человека, метаболизировались в почках и выводились с мочой.
В основе еще одного способа доставки миРНК в раковые клетки лежит использование наночастиц, покрытых молекулами фолиевой кислоты – агента, связывающегося с рецепторами, имеющимися на поверхности большинства раковых клеток. Поверхность этих наночастиц содержит тиольную группу, серосодержащая часть которой связывается с серным элементом золотых наночастиц. Белок глутатион раковых клеток-мишеней замещается на тиольные группы наночастиц, приводя к высвобождению миРНК (Khaled et al., 2005).
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Последние комментарии
