Эмбриональные стволовые клетки: получение и направленная дифференцировка

05.03.2008106200
ВВЕДЕНИЕ

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – это уникальные клеточные популяции, обладающие способностью к самообновлению и дифференцировке в различные клеточные типы. Впервые методики культивирования мышиных эмбриональных стволовых (мЭС) клеток были предложены в 1981 году (1, 2). Человеческие эмбриональные стволовые (чЭС) клетки впервые изолировали в 1994 году (3, 4), а первые стабильные линии чЭС клеток получили в 1998 году (5). С тех пор знания о росте и дифференцировке чЭС клеток значительно расширились благодаря техническим новшествам в манипуляциях с этими клетками. В настоящее время в базе данных Национального института здоровья США (National Institute of Health (NIH)) по морфологическим признакам идентифицированы и классифицированы 78 линий ЭС клеток (6). Плюрипотентные стволовые клетки (клетки, способные образовывать элементы любых типов тканей, кроме экстраэмбриональных, таких как плацента) являются многообещающим объектом для репаративной медицины и тканевой инженерии.

Цель этого обзора – описание методов получения и свойств ЭС клеток с акцентом на эмбриологическом аспекте. Особое внимание уделяется последним достижениям в области культивирования ЭС клеток в плюрипотентном состоянии и способам управления дифференцировкой этих клеток при получении определенных клеточных линий, которые могут стать отправной точкой в развитии новой репаративной терапии.


ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОЛОГИИ ЭСК

Развитие эмбриона начинается с оплодотворения яйцеклетки, которая с этого момента становится зиготой. Постоянное дробление или сегментация зиготы увеличивает количество клеток, заключенных в гликопротеиновую мембрану, называемую zona pellucida или zona striata. Клетки в окружении этой мембраны называют бластомерами, а комплекс бластомеров на этой стадии развития, состоящий из 4-16 клеток, называется морулой (от лат. morulae - тутовая ягода). Когда зигота переходит в состояние морулы, она попадает из фаллопиевой трубы в полость матки. Вскоре после попадания морулы в матку из нее формируется бластула (также называемая зародышевым пузырем или бластосферой) – сфера, образованная клеточным монослоем. Эмбрион на этой стадии развития называется бластоцистой и состоит из 40-150 клеток, окружающих зародышевую полость – бластоцоль, заполненную жидкостью. Клетки внешней части бластоцисты формируют трофобласт – слой клеток, который в свою очередь разрастается в два слоя: внешний – синцитиотрофобласт и внутренний – цитотрофобласт (клетки Лангханса). Внутренняя клеточная масса (ВКМ) (от inner cell mass – ICM), образующая центральную часть бластоцисты, называется также эмбриобластом. В свою очередь, эмбриобласт состоит из двух слоев клеток: эпибласта, смежного с трофобластом и гипобласта, смежного с полостью бластоцисты. Из эпибласта образуется все три зародышевых листка эмбриона – эктодерма, мезодерма и энтодерма (7, 8). Масса внутренних клеток является источником плюрипотентных ЭСК.


ТИПЫ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ЭС клетки

Ранние ЭС клетки - группа клеток, образующихся благодаря делению зиготы, до образования бластоцисты. Эти клетки тотипотентны (от греч. toti- - общий, целый), т.е. они способны преобразовываться в клетки любого типа (9). ЭСК бластоцисты – это клетки внутренней клеточной массы бластоцисты. Эти клетки плюрипотентны (от pluri = plural, множественный), т.е. они могут дифференцироваться практически во все типы клеток организма (10).

Фетальные стволовые клетки

Стволовые клетки фетуса (плода с 9 недели до момента рождения) ответственны за начальное развитие всех тканей до рождения. Эти клетки также плюрипотентны.

Стволовые клетки пуповины

Стволовые клетки пуповинной крови генетически идентичны клеткам новорожденного. Эти клетки мультипотентны, что означает их способность дифференцироваться только в клетки ограниченного числа типов

Взрослые стволовые клетки

Эти стволовые клетки присутствуют в уже сформировавшихся тканях взрослого организма. Взрослые стволовые клетки тоже мультипотентны. Обычно они локализуются среди нервных клеток, в костном мозге или в периферической крови (гемопоэтические клетки, ГСК – наиболее широко применяющий тип стволовых клеток), в мышцах, костях и коже. Особенностью взрослых стволовых клеток является их «пластичность»: будучи клетками одной ткани, они могут дифференцироваться в клетки другой ткани в зависимости от условий, определяющих их рост и дифференцировку.


ПОЛУЧЕНИЕ ЭСК

Человеческие ЭС клетки (чЭС клетки) успешно изолируют из ВКМ бластоцист двумя методами: с помощью избирательного комплемент-зависимого лизиса бластоцист с последующим удалением трофобластов или путем растворения гликопротеиновой мембраны бластоцист ферментом проназой (11). Группа ученых недавно отозвала свои результаты по изолированию линии чЭС клеток из бластоцисты, полученной методом переноса ядра соматической клетки ПЯСК (11).

Мышиные ЭС (мЭС) клетки получают схожим образом из ВКМ эмбриона мыши. Для изолирования мЭС важен статус беременности мыши. От мыши, беременность которой находится в диапаузе, можно получить больше мЭС клеток. Диапауза наступает у мыши, когда она забеременела во время кормления недавно произведенного потомства. Это состояние заключается в естественной отсрочке имплантации бластоцист в матку, вследствие которой происходит задержка эмбрионального развития и увеличивается количество клеток эпибласта (14). В настоящее время удается успешно изолировать стволовые клетки мышей, человека и нескольких типов человекообразных обезьян: макак-резусов, игрунковых и яванских макак (13, 15).



Получение ВКМ микрохирургическим путем. Слева направо: бластоцисты; процедура комплемент-индуцированного лизиса трофобласта; полученные клетки внутренней клеточной массы (ЭСК).



Сепарация внутриклеточной массы и трофэктодермы механическим путем.


КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭСК

Несколько исследовательских групп в настоящее время успешно культивируют ЭС клетки в плюрипотентном состоянии, а также осуществляют направленную дифференцировку этих клеток. В данном обзоре будут рассматриваться только мЭС и чЭС клетки.

Культивирование ЭС клеток в плюрипотентном состоянии

Как отмечалось выше, стволовые клетки обладают свойством «стволовости», т.е. они могут дифференцироваться в клетки любого из трех зародышевых листков. Поддержание недифференцированного состояния стволовых клеток в культуре является непростой задачей, поскольку эти клетки генетически «запрограммированы» на дифференцировку.

Основное отличие в культивировании ЭС клеток от других клеток организма заключается в том, что ЭС клетки невозможно выращивать без поддержки слоя фидерных клеток (13, 15, 16). В качестве фидерного слоя обычно используют митотически инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФы), хотя разные исследовательские группы пытаются найти альтернативу МЭФам.

Культивирование мЭС клеток

Мышиные ЭС клетки выращивают в богатой среде для ЭС клеток на фидерном слое из митотически инактивированных МЭФов для поддержания их недифференцированного состояния. Предотвращение дифференцировки достигается за счет фидерного слоя и фактора ингибирования лейкемии LIF (leukaemia inhibitory factor), добавленного в среду культивирования. Мышиные ЭС клетки образуют в процессе роста колонии округлой формы (17). Клетки пассируют (пересевают), когда они еще не начали дифференцироваться, а колонии почти сливаются. Обычно ЭС клетки пассируют каждые 2-3 дня, чтобы предотвратить дифференцировку (18, 19).

Культивирование чЭС клеток

Для продолжительной наработки недифференцированных чЭС клеток необходимо наличие фидерного слоя и сыворотки или, при культивировании в бессывороточной среде, - основных факторов роста фибробластов bFGF (basic fibroblast growth factor) (20, 21). ЭС клетки человека можно выращивать на поддерживающем слое из МЭФов в среде для чЭС клеток.

Человеческие ЭС клетки формируют плоские компактные колонии при выращивании в подходящих условиях на чашках с фидерным слоем из МЭФов. Клетки характеризуются высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением и хорошо различимыми ядрышками. Когда колонии почти соприкасаются, клетки пассируют, что происходит обычно каждые 4-6 дней.

Ниже приводятся параметры, по которым устанавливают плюрипотентность и исключают дифференцировку ЭС клеток.

1. Морфологическими признаками дифференцировки являются большие колонии с некротическими центрами, похожие скорее на отдельные клетки, чем на массу синциотрофобластов. Колонии окружены плоскими клетками, визуально отличающимися от недифференцированных клеток.
2. Недифференцированные чЭС клетки экспрессируют такие поверхностные иммунологические маркеры, как стадиеспецифичные антигены SSEA-3 и SSEA-4 (stage-specific embryonic antigens) и антигены реакции отторжения опухоли TRA-1-60, TRA-2-54 и TRA-1-81 (tumor rejection antigens). Недифференцированные мЭС клетки экспрессируют только поверхностный антиген SSEA-1, который появляется в чЭС клетках после дифференцировки (22-27).
3. Недифференцированные стволовые клетки характеризуются высокой активностью щелочных фосфатаз, которая уменьшается после дифференцировки (23).
4. Количество транскрипционного фактора Octamer-4 (Oct-4) снижается в клетках при дифференцировке (27, 28, 29).
5. При дифференцировке в клетках исчезает белок промежуточных филаментов цитоскелета нестин (nestin), экспрессируемый во многих типах стволовых клеток и в популяции клеток-предшественниц нейроэктодермы и мезодермы (11, 30).
6. Высокая теломеразная активность (активность фермента теломеразы, отвечающей за предотвращение укорочения концов хромосом при пролиферации клеток) ЭСК коррелирует со способностью стволовых клеток бесконечно делиться в культуре (11, 31, 32).
7. Анализ плюрипотентности in vitro. При выращивании ЭС клеток в суспензии из них формируются трехмерные агрегаты дифференцированных клеток – эмбриоидные тела (ЭТ). При длительном культивировании ЭТ из них можно изолировать производные всех трех зародышевых листков, такие как гематопоэтические, эндотелиальные, нейрональные клеточные линии, а также линии кардиомиоцитов (33). Формирование ЭТ – не единственный путь инициирования дифференцировки ЭСК. Альтернативный эффективный и быстрый способ индукции спонтанной дифференцировки этих клеток очень прост: необходимо оставить колонии ЭС клеток на поддерживающем слое МЭФов без пассирования на срок, превышающий неделю (11, 33).
8. Анализ плюрипотентности in vivo. При трансплантации кластеров из колоний ЭС клеток мышам с тяжелой комбинированной иммунологической недостаточностью (т.н. severe combined immunodeficient (SCID) mice) из ЭС клеток формируются доброкачественные опухоли – тератомы, состоящие из клеток-производных эктодермы, мезодермы и эндодермы (11, 20, 34, 35).

Роль фидерных клеток и их альтернативы

Для роста ЭС клеток в недифференцированном состоянии необходим поддерживающий слой из фидерных клеток (36). Обычно в качестве такого слоя используют митотически инактивированные МЭФы. МЭФы производят фактор ингибирования лейкемии (leukaemia inhibitory factor (LIF)), который активирует транскрипционный фактор STAT3 мЭС клеток, необходимый для пролиферации этих клеток в недифференцированном состоянии in vitro (37-40). Существуют следующие альтернативы МЭФам:

Альтернативы МЭФам для мЭС клеток:

1. «Стволовость» мЭС клеток можно поддерживать путем добавления ростового фактора LIF в среду культивирования этих клеток, содержащую сыворотку (41, 42).
2. Другая альтернатива сыворотки и белка LIF для поддержания недифференцированного состояния мЭС клеток – добавление в культуральную среду морфогенетического белка костной ткани (bone morphogenetic protein (BMP)), или так называемых факторов роста и дифференцировки (growth and differentiation factors (GDFs)) (43).
3. Белок Nanog - транскрипционный фактор, экспрессирующийся в дифференцированных клетках в ничтожно малых количествах. Высокое содержание этого белка в мЭС клетках препятствует их дифференцировке, а также блокирует ответы этих клеток на стимулы, вызывающие дифференцировку (44, 45).

Альтернативы МЭФам для чЭС клеток:

В противоположность мЭС клеткам, ростовой фактор LIF не предотвращает дифференцировку чЭС клеток в отсутствие фидерного слоя по неясным причинам (46, 47).

Независимые группы исследователей рассматривали следующие альтернативы МЭФам:

Альтернативные фидерные слои

1. Человеческие ЭС клетки культивировали в плюрипотентном состоянии на фидерном слое из постоянной клеточной линии STO, полученной из эмбрионов мыши. Предполагается, что клетки STO могут производить достаточные количества молекулярных сигнальных факторов для обновления чЭС клеток и их поддержания в недифференцированном состоянии. Выращивать чЭС клетки невозможно без непосредственного контакта с фидерными клетками линии STO, по-видимому, из-за недостаточной секреции последними растворимых факторов, необходимых для самообновления чЭС клеток (35).

Возможность потенциального использования чЭС клеток, выращенных на фидерном слое из клеток животных, в репаративной медицине ограничивает тот факт, что патогены животных могут переноситься от фидерного слоя из клеток животных к чЭС клеткам. Поэтому необходимо выяснить, возможно ли в качестве фидерного слоя использовать клетки человека.

2. Фидерным слоем могут послужить паренхимальные клетки из молочной железы человека hBPCs (human adult breast parenchymal cells). Человеческие ЭС клетки, выращенные на таком фидерном слое, обладают сходной морфологией с МЭФами, т.е. высоким ядерно-цитоплазматическим отношением и близким расположением клеток в культуре (51).

3. В качестве фидерного слоя можно использовать человеческие эмбриональные фибробласты (чЭФы). Человеческие ЭС клетки, выращенные на фидерном слое из чЭФов, выглядят более тонкими и плоскими, и характеризуются бОльшим межклеточным расстоянием по сравнению с чЭС клетками, выращенными на подложке из МЭФов или hBPCs (51).

4. Человеческие ЭСК, культивируемые на фидерном слое из человеческих эндотелиальных клеток матки hUECs (human adult uterine endometrial cells), обладают сходными свойствами с чЭС клетками, выращенными на подложке из чЭФов. Для поддержания недифференцированного состояния чЭС клеток на подложке из hUECs важна фаза, в которой находились hUECs клетки при их изолировании: пролиферативная фаза способствует сохранению недифференцированного состояния чЭС клеток, а лютеиновая фаза – нет (51, 52).

5. Группа ученых исследовала 11 фидерных слоев из фетальных, неонатальных клеток человека и различных клеток взрослого человека в качестве фидерного слоя для чЭС клеток. Оптимальными подложками для чЭС клеток оказались фидерные слои из человеческих фетальных мышечных клеток, клеток кожи взрослого человека и коммерческих фетальных клеток кожи D551/CCL-10. Эти подложки превосходили по своим свойствам традиционные МЭФы, т.к. процент полностью недифференцированных колоний на этих фидерных слоях составлял 70-90%, а в случае МЭФов – 65-75% (53).

6. Клетки амниотического эпителия человека HAE (human amniotic epithelial cells) и клетки хориальной пластинки человека HCP (human chorionic plate) использовали в качестве подложки для роста ЭС клеток яванских макак. Предполагают, что эти фидерные слои можно использовать для культивирования недифференцированных клеток человека из-за генетического сходства яванских макак и человека (54, 55).

Использование специальных сред

1. Недифференцированное состояние чЭС клеток в культуре можно успешно поддерживать с помощью среды, в которой выращивали МЭФы (56). Для выживания и роста большинству клеток необходима адгезия к внеклеточному матриксу. Человеческие ЭС клетки экспрессируют интегрины альфа-6 и бета-1 - рецепторы для взаимодействия с молекулами клеточной адгезии и растворимых факторов, высвобождаемых МЭФами.

2. В одном исследовании оценили способность различных матриксов поддерживать рост чЭС клеток в средах, в которых выращивали МЭФы (57). Человеческие ЭС клетки, культивированные на «Матригеле» (Matrigel) в среде, взятой от МЭФов (т.н. кондиционированная среда), отличались хорошей выживаемостью и недифференцированной морфологией. Рост чЭС клеток в плюрипотентном состоянии обеспечивает комбинация подходящих матриксных белков, таких как «Матригель» или ламинин, и среды, в которой выращивали МЭФы.

3. Не удалось культивировать чЭС клетки без дифференцировки в средах, в которых выращивали клетки, отличные от МЭФов, такие как NHG, STO, BJ5ta и hTERT-RPE (57). Таким образом, среды, взятые только от определенных клеток, способны поддерживать недифференцированный рост чЭС клеток. По-видимому, наряду с высвобождением факторов, поддерживающих рост чЭС клеток, эти клетки не способны удалять токсичные вещества, присутствующие в среде.

Помимо этого:

Недавно обнаружили пептид Активин А (Activin A) - один из растворимых факторов, секретируемых фидерным слоем и поддерживающих «стволовость» чЭС клеток. Этот белок высвобождается МЭФами. Человеческие ЭС клетки, выращиваемые в среде, обогащенной этим фактором, способны длительное время сохранять плюрипотентное состояние (59).

В работе, опубликованной в 2004 году (60), доказывается возможность выращивания чЭС клеток без сыворотки и без фидерного слоя. Человеческие ЭС клетки хорошо растут на фибронектиновом внеклеточном матриксе в среде, содержащей комбинацию из фактора роста фибробластов FGF2 (fibroblast growth factor-2), трансформирующего фактора роста-бета TGFβ (transforming growth factor-β), LIF и подходящего заменителя сыворотки.

Можно добиться краткосрочной поддержки чЭС клеток без фидерного слоя при помощи модуляциии сигнального пути через фактор Wnt (молекулярной сигнальной сети, играющей важную роль в эмбриогенезе, в развитии рака и в нормальных физиологических процессах у взрослых особей млекопитающих) (48).


НАПРАВЛЕННАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Как уже говорилось выше, стволовые клетки способны «выбирать» между продолжением развития по пути самообновления или дифференцировкой. Путь развития стволовых клеток определяется внутренними сигналами и микроокружением этих клеток. К настоящему времени накоплено недостаточно знаний, позволивших бы искусственно регулировать выбор пути развития мЭС или чЭС клеток. Различными исследовательскими группами делаются попытки управлять дифференцировкой стволовых клеток как во время их продолжительного созревания, так и после формирования эмбриоидных телец (61-75).

ЭСК мыши

Традиционные методы дифференцирования ЭС клеток заключаются в совместном культивировании этих клеток с индуцирующими дифференцировку клетками, обработке ЭС клеток ростовыми факторами, или том и другом одновременно (76). Выбор методики зависит от желаемого результата. При необходимости управления дифференцировкой в желаемом направлении выбирают индукцию ростовыми факторами. Если следует просто улучшить рост и выживаемость спонтанно дифференцирующейся клеточной популяции – выбирают первый способ.

Эктодермальная дифференцировка: Различным исследовательским группам удалось успешно направлять дифференцировку мЭС клеток в нейроэктодермальные клетки. Группа ученых под руководством Р.Д. МакКэй (McKay R.D.) разработала пятиступенчатую in vitro-систему, позволяющую контролировать дифференцировку мЭС клеток в нейроны среднего мозга, продуцирующие дофамин, и в нейроны ромбовидного мозга, вырабатывающие серотонин (77).

Мезодермальная дифференцировка: Некоторые группы ученых добились дифференцировки мЭС клеток в эндотелиальные клетки при помощи добавления эндотелиального фактора роста сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF) в питательную среду мЭС клеток. Эти клетки формируют цилиндрические, ветвистые структуры, похожие по своей организации на кровеносные сосуды мышей. Примитивные клетки крови формировались внутри трубочек. При инъекционном ведении этих примитивных эндотелиальных клеток в развивающиеся сердца куриного эмбриона, находящегося на 16-17 стадии развития, они населяли кровеносные сосуды головы, сердца, желточного мешка и пространства между сомитами (спинными сегментами) цыплят и формировали там эндотелиальные и пристеночные клетки. Это доказывает, что ЭС клетки могут не только дифференцироваться в клетки разных типов, но способны генерировать клетки многих типов, которые затем спонтанно организуются в ткани, аналогичные тканям организма (78).

Недавно разработанная методика (79) позволяет направлять дифференцировку мЭС клеток в гемопоэтические клетки-предшественницы и контролировать каждую стадию процесса с помощью инкапсулирования отдельных эмбриоидных телец в агарозные гидрогелевые капсулы с последующим помещением их в условия гипоксии.

Энтодермальное дифференцирование: Мышиные ЭС клетки могут активировать гены, отвечающие за дифференцирование этих клеток в клетки эндодермы как in vivo, так и [/i]in vitro[/i] (70, 80). Они могут дифференцироваться в клетки островков Лангерганса, продуцирующие инсулин, и в гепатоциты (13). Образовавшиеся клетки сложнее визуально идентифицировать в культуре ЭС клеток, чем эндотелиальные клетки или клетки крови.

чЭС клетки

Когда чЭС клетки снимают с фидерного слоя и помещают в суспензию, они формируют эмбриоидные тельца (ЭТ). Понимание морфологии чЭТ и изучение направленной дифференцировки чЭС клеток поможет расширить знания о ранних событиях, управляющих развитием человека.

Дифференцировка in vitro: экстраэмбриональные клеточные линии. При выращивании чЭС клеток в среде, содержащей BMP4 (bone morphogenetic protein 4, морфогенетический белок костной ткани-4) в отсутствии сыворотки, или в среде с сывороткой и белком BMP2, из них формируются плоские эпителиальные клетки двух типов: клетки, продуцирующие белки, ответственные за развитие трофобласта, и клетки, образующие экстраэмбриональную эндодерму (81). Путем регулирования экспрессии гена Oct-4 можно управлять дифференцированием чЭС клеток. Нокаут гена Oct-4 с помощью коротких интерферирующих РНК (siRNA, short interfering RNA ) приводит к дифференцировке чЭС (и мЭС) клеток в клетки трофобласта и энтодермы (82, 83). С помощью искусственно сконструированного цинк-фингерного белка (белка, содержащего так называемый домен «цинковые пальцы») (zinc-finger protein, ZPF) , регулирующего продукцию белка Oct-4, удалось добиться управления дифференцировкой мЭС клеток. При стимуляции выработки белка Oct-4 из этих клеток формировались клетки примитивной энтодермы или мезодермы, а при подавлении экспрессии белка Oct-4 – мЭС клетки дифференцировались в клетки трофоэктодермы (84-86).

Дифференцировка в эктодерму: Культивирование чЭС клеток в традиционной питательной среде (basal mediun), содержащей фактор роста фибробластов FGF2 и антагонист BMP4, способствует дифференцировке этих клеток в клетки промежуточного типа, которые можно легко преобразовать в клетки-предшественницы нервной ткани (81). Эти клетки-предшественницы могут дифференцироваться в астроциты, нейроны и, в меньшей степени, в олигодендроциты. Применение ретиноевой кислоты и фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF) (87) или кондиционной среды (88) повышает выход нервных клеток из ЭТ, образованных чЭС клетками.

Эксперименты на ЭС клетках яванских макак показали, что индуктор активности, ассоциированный со стромальными клетками SDIA (stromal cell-derived inducing activity), направляет дифференцировку ЭС клеток в клетки-предшественницы центральной нервной системы (89, 90).

Мезодермальная дифференцировка: Описаны способы направленной дифференцировки чЭС клеток в эндотелий. Такие дифференцирующиеся культуры экспрессируют ранние и поздние эндотелиальные маркеры (например, CD34 и CDGATA2 или фактор vWF (von Willebrand factor), соответственно). Более того, in vitro они формируют трубчатые структуры, а при введении их in vivo мышам с экспериментально индуцированным иммунодефицитом образуют функционирующие микрососуды.

Группа ученых под руководством К. Чадвика (K. Chadwick) добилась шестикратного увеличения выхода эндотелиальных клеток путем обработки гемопоэтическими цитокинами (фактором стволовых клеток, лигандом FLT3, интерлейкином-3, интерлейкином-6 и фактором, стимулирующим формирование колоний гранулоцитов) формирующихся эмбриоидных телец.

Нескольким исследовательским группам удалось изолировать группы сокращающихся кардиомиоцитов из спонтанно дифференцирующихся эмбриоидных телец человека и из чЭС клеток, культивировавшихся совместно с клетками других культур (таких как END-2) (94-96).

Энтодермальная дифференцировка: Получение энтодермальных клеток из чЭС клеток является не простой задачей. В одной работе продемонстрировали, что во время образования эмбриоидных телец (ЭТ) из чЭС клеток, в последних экспрессируются гены, ответственные за формирование клеток-предшественниц поджелудочной железы, а с помощью обработки анти-инсулиновыми антителами удалось обнаружить эти клетки в сформированных ЭТ (97, 98). В другом исследовании удалось добиться дифференцировки чЭС клеток в клетки-предшественницы гепатоцитов двумя способами: с помощью обработки чЭС клеток бутиратом натрия во время формирования ЭТ и последовательным воздействием диметилсульфоксида (DMSO) и бутирата натрия на чЭС клетки, выращиваемые на фидерном слое (99).

Дифференцировка in vivo: Несмотря на успехи, достигнутые в дифференцировке ЭС клеток в различные эмбриональные клетки и клетки взрослого организма in vitro, попытки воссоздать фрагменты тканей или смоделировать органогенез in vivo не привели к значительным результатам. Человеческие ЭС клетки, инъецированные мышам с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (severe combined immunodeficient (SCID) mice), формировали тератомы с дифференцированными тканями всех трех зародышевых листков (20). В образованных тератомах можно различить клетки поперечно-полосатых мышц, клетки зародышевых клубочков, кишечника, дыхательного эпителия, плоского эпителия, волос, клеток нейрального эпителия и ганглиев, а также клетки гладкомышечной, костной и хрящевой тканей. Дифференцированными чЭС клетками воспроизводятся основные характеристики архитектуры тканей, т.е. эпителиальные клетки обладают полярностью, крепятся к базальной мембране и окружены мезенхимными элементами. Дифференцировка чЭС клеток in vivo является более завершенной, чем аналогичный процесс in vitro. В связи с этим большой интерес представляют методики, позволяющие экстрагировать интересующие клетки или ткани из гетерогенной смеси тканей тератомы, либо способы направленной дифференцировки чЭС клеток в определенную ткань in vivo. В число этих методик входят:

1. добавление определенных комбинаций химических морфогенов или ростовых факторов (98, 100);
2. совместное культивирование или трансплантация ЭС клеток вместе с индуцирующими клетками;
3. имплантация ЭС клеток в определенные органы или ткани животных (88),
4. стимуляция экспрессии тканеспецифичных гомеобокс-содержащих генов, кодирующих транскрипционные факторы, действующие на ранних стадиях эмбриогенеза (101, 102);
5. отбор клеток с активированными генами, соответствующими определенным программам дифференцировки (70, 103, 104);
6. изолирование интересующих клеток с помощью метода флюоресцентной сортировки клеток FACS (fluorescence activated cell sorting) (105, 106).

Определенные успехи достигнуты в направленной дифференцировке чЭС клеток in vivo с помощью одного из перечисленных выше методов или их комбинации. При трансплантации клеток-предшественниц нервной ткани (дифференцированных из чЭС клеток in vitro) в мозг новорожденного мышонка, эти клетки мигрировали из места введения и дифференцировались в соответствующие нервные клетки на периферии (87, 107). Из эндотелиальных клеток, дифференцированных in vitro из чЭС клеток и введенных мышам с индуцированным иммунодефицитом, формировались функционирующие микрососуды (92).


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эмбриональные стволовые клетки можно рассматривать как самообновляющийся источник клеток многих типов, таких как кардиомиоциты, бета-клетки поджелудочной железы, дофамин-продуцирующие нейроны и ГСК. Клетки, полученные из ЭСК, обладают огромным потенциалом для исследовательских и терапевтических нужд, но использование этих клеток ограничено невозможностью их наработки в достаточных количествах. Знания в области культивирования и манипуляций с ЭС клетками значительно расширились в последние годы, однако несколько технических вопросов остаются до настоящего времени открытыми. Это наработка больших количеств недифференцированных ЭС клеток без фидерного слоя, выращивание из них клонов и простые и эффективные методики генетических манипуляций с ними. Интересно установить, какую роль играют основные регуляторные пути эмбриогенеза в росте и дифференцировке ЭСК. В заключение следует отметить, что перед тем, как применять эмбриональные стволовые клетки в клеточной трансплантологии, необходимо получить более глубокие знания об основах биологии эмбриональных клеток и, в частности, о регуляторных путях, вызывающих самообновление и дифференцировку ЭСК.


По материалам:
Biswas A., Hutchins R. Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. April 1, 2007, 16(2): 213-222.

Подготовила: Дарья Червякова, Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология»


ЛИТЕРАТУРА

REFERENCES
1. Evans MJ and MH Kaufman (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292:154-6.
2. Martin GR. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78:7634-8.
3. Bongso A, C-Y Fong, SC Ng et al. (1994). The growth of inner cell mass cells from human blastocysts (abstract). Theriogenology 41:161.
4. Bongso A, C-Y Fong, SC Ng et al. (1994). Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum Reprod 9:2110-7.
5. Thompson JA, J Itskovitz-Eldor, SS Shapiro. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:1145-7.
6. Zeng X, T Miura, Y Luo et al. (2004). Properties of pluripotent human embryonic stem cells BG01 and BG02. Stem Cells 22:292-312
7. Moore KL, T Persaud, K Shiota. Colour Atlas of Clinical Embryology, 2nd ed. (2000). Elsevier Health Science Division, Philadelphia, PA, 1–12.
8. Harding R and AD Bocking. Fetal Growth and Development. (2001). Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1-16.
9. Capasso D and E Brown et al. Genetic Science Learning Centre, University of Utah. http://gslc.genetics.utah.edu/units/stem cells/whatissc/.
10. Capasso D, E Brown, R Call et al. Genetic Science Learning Centre, University of Utah. http://gslc.genetics.utah.edu/units/stem/. cells/index cfm.
11. Heins N, MCO Englund, C Sjoblom, U Dahl et al. (2004). Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 22:367–376.
12. Hwang WS, YJ Ryu, JH Park, ES Park, SJ Kim et al. (2004). Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science 303:1669–1674. Retraction in: Kennedy D. (2006). Science 311(5759):335.
13. Stem cell information: Mouse embryonic stem cell cultures. National Institutes of Health (NIH). Available at http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics3/ Last accessed April 2007.
14. Simeone A. (1998). Otx1 and Otx2 in the development and evolution of the mammalian brain. EMBO J 17:6790-8.
15. Thomson JA, J Kalishman, TG Golos et al. (1995). Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Acad Sci USA 92:7844-8.
16. Pera MF, B Reubinoff and A Trounson. (2000). Human embryonic stem cells. J Cell Sci 113:5–10.
17. Brook FA and RL Gardner. (1997). The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Natl Acad Sci USA 194:5709-12.
18. Tompers DM and PA Labosky. (2004). Electroporation of murine embryonic stem cells: A step-by step guide. Stem Cells 22:243-9.
19. Matise MP, W Auerbach and AL Joyner. (2000). Production of targeted embryonic stem cell clones. In: Gene Targeting, A Practical Approach, 2nd ed. Oxford University Press, Cambridge, UK, pp 101-31.
20. Thomson JA, J Itskovitz-Eldor, SS Shapiro et al. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:1145-7.
21. Amit M, MK Carpenter, MS Inokuma et al. (2000). Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev Biol 227: 271-8.
22. Chemicon International. (2003). Reagents for Pluripotent Stem Cell Research.
23. Amit M and J Itskovitz-Eldor. (2002). Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J Anat 200:225-32.
24. Gilbert SF. Developmental Biology, 6th ed. (2000). Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.
25. Andrews PW, J Casper, I Damjanov et al. (1996). Comparative analysis of cell surface antigens expressed by cell lines derived from human germ cell tumours. Int J Cancer 66:806-16.
26. Knowles BB, DP Aden and D Solter. (1978). Monoclonal antibody detecting a stage-specific embryonic antigen (SSEA-1) on pre-implantation mouse embryos and teratocarcinoma
calls. Curr Top Microbiol Immunol 81: 51-3.
27. Niwa H, J Miyazaki and AG Smith. (2000). Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, de-differentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genet 24:372-6.
28. Hansis C, JA Grifo and LC Krey. (2000). Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocysts. Mol Hum Reprod 6: 999-1004.
29. Lebkowski JS, J Gold, C Xu et al. (2001). Human embryonic stem cells: culture, differentiation and genetic modification for regenerative medicine applications. Cancer J 7(suppl 2):83-93.
30. Lendahl U, LB Zimmerman and RD McKay. (1990). CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell 60:585-95.
31. Thomson JA and VS Marshall. (1998). Primate embryonic stem cells. Curr Top Dev Biol 38:133-65.
32. Odorico JS, DS Kaufman and JA Thomson. (2001). Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells 19:193-204.
33. Itskovitz-Eldor J, M Schuldiner, D Karsenti et al. (2000). Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Mol Med 6:88-95.
34. Vescovi Al, EA Parati, A Gritti et al. (1999). Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp Neurol 156:71-83.
35. Park JH, SJ Kim, HS Yoon et al. (2003). Established and maintainance of human embryonic stem cells on STO, a permanently growing cell line. Biol Reprod 69:2007-14.
36. Robertson EJ. (1987). Teratocarcinoma and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. IRL Press Limited, Oxford, 71-112.
37. Rathjen PD, S Toth, A Wills, JK Heath and AG Smith. (1999). Differentiation inhibiting activity is produced in matrix-associated and diffusible forms that are generated by alternate promoter usage. Cell 62:1105-14.
38. Burdon T, I Chambers, C Stracey, H Niwa and A Smith. (1999). Signaling mechanisms regulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells. Cells Tissues Organs 165:131-43.
39. Matsuda T, T Nakamura, K Nakao, T Yokota et al. (1999). STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells. EMBO J 18:4261-9.
40. Niwa H, T Burdon, I Chambers and A Smith. (1998). Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev 12:2048-60.
41. Williams RL, DJ Hilton, NM Gough et al. (1988). Myeloid leukaemia factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature 336:684-7.
42. Smith AG, JK Heath, DD Donaldson et al. (1988). Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature 336:688-90.
43. Ying QL, J Nichols, I Chambers and A Smith. (2003). BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell 115:281-92.
44. Mitsui K, Y Tokuzawa, H Ito et al. (2003). The homeoprotein Nanog is required for maintainance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 113:631-42.
45. Yates A and I Chambers. (2005). The homeodomain protein Nanog and pluripotency in mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans 33:1518-21.
46. Carpenter MK, E Rosler and MS Rao. (2003). Characterization and differentiation of human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells 5:79-88.
47. Reubinoff BE, MF Pera, CY Fong, A Trounson and A Bongso. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnol 18:399-404.
48. Sato N, L Meijer, L Skaltsounis et al. (2004). Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signalling by a pharmacological GSK-3–specific inhibitor. Nature Med 10:55-63.
49. Richards M, SP Tan, JH Tan, WK Chan and A Bongso. (2004). The transcriptome profile of human embryonic stem cells as defined by SAGE. Stem Cells 22:51-64.
50. Ginis I, Y Luo, T Miura, J Itskovitz-Eldor et al. (2004). Differences between human and mouse embryonic stem cells. Dev Biol 69:360-80.
51. Lee JB, JM Song, HS Yoon et al. (2004). Available human feeder cells for the maintenance of human embryonic stem cells. Reproduction 128:727-35.
52. Lee JB, JE Lee, HS Yoon et al. (2005). Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition. Biol Reprod 72:42-9.
53. Richards M, S Tan and A Bongso. (2003). Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 21:546-56.
54. Miyamoto K, Hayashi, Y Ito et al. (2004). Human placenta feeder layers support undifferentiated growth of primate embryonic stem cells. Stem Cells 22:433-40.
55. Suemori H, T Tada, R Torii et al. (2001). Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey blastocytes produced by IVF or ICSI. Dev Dyn 22:273-9.
56. Robins A and T Schulz. Human Embryonic Stem Cell Protocols. (2004). Bresagen, Inc., Athen, GA.
57. Xu C, MS Inokuma, MK Carpenter et al. (2001). Feeder free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotech 19:971-4.
58. Bodnar AG et al. (1998). Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279:349-52.
59. Beattie GM, AD Lopez and A Hayek. (2005). Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Stem Cells 23:489-95.
60. Amit M, C Shariki, V Margulets and J Itskovitz-Eldor. (2004). Feeder and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod 70:837-45.
61. Rathjen PD, J Lake, LM Whyatt et al. (1998). Properties and uses of embryonic stem cells: prospects for application to human biology and gene therapy. Reprod Fertil Dev 10:31–47.
62. Doetschman TC, H Eistetter, M Katz et al. (1985). The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J Embryol Exp Morphol 87: 27-45.
63. Baker RK and GE Lyons. (1996). Embryonic stem cells and in vitro muscle development. Curr Top Dev Biol 33:263-79.
64. Keller GM. (1995). In-vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol 7:862-9.
65. Rohwedel J, V Maltsev, E Bober et al. (1994). Muscle cell differentiation of embryonic stem cells reflects myogenesis in vivo: developmentally regulated expression of myogenic determination genes and functional expression of ionic currents. Dev Biol 164:87-101.
66. Drab M, H Haller, R Bychkov et al. (1997). From totipotent embryonic stem cells to spontaneously contracting smooth muscle cells: a retinoic acid and db-cAMP in vitro differentiation model. FASEB J 11:905-15.
67. Brustle O, KN Jones, RD Learish et al. (1999). Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinating transplants. 285:754-6.
68. Abe K, H Niwa, K Iwase et al. (1996). Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Exp Cell Res 229:27-34.
69. Brustle O and RD McKay. (1996). Neuronal progenitors as tools for cell replacement in the nervous system. Curr Opin Neurobiol 6:688-95.
70. Dani C. (1999). Embryonic stem cell-derived adipogenesis. Cells Tissues Organs 165:173-80.
71. Soria B, E Roche and G Berna et al. (2000). Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozocin-induced diabetic mice. Diabetes 49:157-62.
72. Bain G, D Kitchens, M Yao et al. (1995). Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol 168: 342-57.
73. Poliard A, A Nifuji, D Lamblin et al. (1995). Controlled conversion of an immortalized mesodermal progenitor cell towards osteogenic, chondrogenic or adipogenic pathways. J Cell Biol 130:1461-72.
74. Yamane T, S Hayashi, M Mizoguchi et al. (1999). Derivation of melanocytes from embryonic stem cells in culture. Dev Dyn 216:450-58.
75. Risau W, H Sariola, HG Zerwes et al. (1988). Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic stem cell derived embryoid bodies. Development 102:471-8.
76. Pera MF and AO Trounson. (2004). Human embryonic stem cells: prospects for development. Development 131: 5515-25.
77. Lee SH, N Lumelsky, L Studer, JM Auerbach and RD McKay. (2000). Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Biotechnol 18:675-9.
78. Yamashita J, H Itoh, M Hirashima and S Nishikawa. (2000). Flk1–positivecells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature 408:92-6.
79. Dang SM, S Gerecht-Nir and PW Zandstra. (2004). Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells 22:275-82.
80. Jacobson L, B Kathan, J Djamali et al. (2001). Differentiation of endoderm derivatives, pancreas and intestine, from rhesus embryonic stem cells. Transplant Proc 33: 674.
81. Pera MF, J Andrade, C Mummery et al. (2004). Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J Cell Sci 117:1269-80.
82. Hay DC, L Sutherland, J Clark and T Burdon. (2004). Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells. Stem Cells 22:225-35.
83. Burdon T, A Smith and P Savatier. (2002). Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol 12:432-8.
84. Bartsevich VV, C Jeffrey, C Miller, CC Case and CO Pabo. (2003). Engineered zinc finger proteins for controlling stem cell fate. Stem Cells 21:632-7.
85. Pabo CO, E Peisach and RA Grant. (2001). Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins. Annu Rev Biochem 70:313-40.
86. Isalan M, A Klug and Y Choo. (2001). A rapid, generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the HIV-1 promoter. Nature Biotechnol 19: 656-60.
87. Schuldiner M, R Eiges and N Benvenisty. (2001). Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res 913:201-5.
88. Schulz TC, GM Palmarini, BG Condie et al. (2003). Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci 4:27.
89. Kawasaki H, H Suemori, K Mizuseki, S Nishikawa et al. (2002). Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cellderived inducing activity. Proc Natl Acad Sci USA 99: 1580-5.
90. Mizuseki K, T Sakamoto, K Watanabe, H Kawasaki et al. (2003). Generation of neural crest-derived peripheral neurons and floor plate cells from mouse and primate embryonic
stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100:5828-33.
91. Green H, K Easley and S Iuchi. (2003). Marker succession during the development of keratinocytes from cultured human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100:15625-30.
92. Levenberg S, JS Golub, M Amit, J Itskovitz-Eldor and R Langer. (2002). Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 99:4391-6.
93. Chadwick K, L Wang, L Li and M Bhatia. (2003). Cytokines and BMP-4 promote haematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood 102:906-15.
94. Kehat I, D Kenyagin-Karsenti, M Snir and L Gepstein. (2001). Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest 108:407-14.
95. Xu C, S Police, N Rao and MK Carpenter. (2002). Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Circ Res 91:501-8.
96. Mummery C, D Ward-van Oostwaard, M Pera, AB de la Riviere et al. (2003). Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation 107:2733-40.
97. Assady S, G Maor, M Amit and M Tzukerman. (2001). Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 50:1691-7.
98. Bonner-Weir S, M Taneja, GC Weir et al. (2000). In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc Natl Acad Sci USA 97:7999-8004.
99. Rambhatla L, CP Chiu, P Kundu, Y Peng and MK Carpenter. (2003) Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells. Cell Transplant 12:1-11.
100. Schuldiner M, O Yanuka, J Itskovitz-Eldor et al. (2000). Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 97:11307-12.
101. Levinson-Dushnik M and N Benvenisty. (1997). Involvement of hepatocyte nuclear factor 3 in endoderm differentiation of embryonic stem cells. Mol Cell Biol 17: 3817-22.
102. Feber S, A Halkin, H Cohen et al. (2000). Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozocin-induced hyperglycaemia. Nature Med 6:568-72.
103. Li M, L Pevny, R Lovell-Badge et al. (1998). Generation of purified neural precursors from embryonic stem cell by lineage selection. Curr Biol 8:971-4.
104. Klug MG, MH Soonpaa, GY Koh et al. (1996). Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embryonic stem cells from stable intracardiac grafts. J Clin Invest 98:216-24.
105. Weissman IL. (2000). Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell 100: 157-68.
106. Li A, PJ Simmons and P Kaur. (1998). Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc Natl Acad Sci USA 95: 3902-7.
107. Zhang SC, M Wernig, ID Uncan, O Brustle and JA Thomson. (2001). In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnol 19:1129-33.

Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей