Условия культивирования животных клеток in vitro

17.04.200792430

См. начало раздела о культурах животных клеток и тканей.

Животные клетки: питательные среды и условия культивирования


Питательные среды для клеток животных и человека должны обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т.е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.


Условия культивирования животных клеток – это определенные требования к составу питательной среды, соотношению CO2/O2 и поверхности субстрата.
Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотнощелочной баланс среды в процессе культивирования.
Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования.


Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатносолевой буфер Дульбекко и Фогта используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток.
Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах эти величины близки.
Осмоляльность раствора (осмоль/кг) = S mi*xi, где mi концентрация i-го растворенного вещества (моль/кг), xi количество частиц, на которые диссоциировала его молекула. Например, для раствора Эрла расчетная величина осмоляльности равна 310.6 мосмоль/кг, реальная 283.
Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Например, для клонального роста диплоидных фибробластов человека WI38 оптимальны рН=7.30 + 0.15 и осмоляльность 285 + 40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона цыпленка 7.12 + 0.18 и 300 + 20 соответственно.
Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: HCO3 = CO2 + OH, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2.
Если культуры ведутся вне СО2инкубатора, где рН поддерживать труднее, необходимы альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES легко растворим в воде, не связывает двухвалентные катионы, не цитотоксичен до концентрации 0.05 Моль. Применяется в концентрациях 0.01 0.03 М.


Стандартные среды для ведения культур животных клеток – Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ. Она содержит минеральные вещества, аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа раствор Эрла.


Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5 – 20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.


Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост клеток. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Большинство ростовых факторов присутствуют в сыворотке в концентрации нескольких нанаграммов на миллилитр и ниже. Некоторые из этих факторов специфичны для клеток на определенной стадии дифференцировки, действие других не ограничено каким-либо одним типом клеток.

В последние годы разработаны бессывороточные среды для размножения клеток. Чаще всего эти среды узко специализированы, т.е. предназначены для определенного типа клеток. К базовой среде добавляется инсулин, трансферрин, гидрокортизон или его аналог дексаметазон и т.д.


Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и распластаться на нем. В связи с этим встает вопрос о подходящем материале.
В качестве субстрата в настоящее время используют несколько материалов.
Лучше всего – пирекс (алюмоборосиликатное стекло), так как натрий-силикатное стекло может подщелачивать среду и его необходимо кипятить в слабой кислоте перед употреблением. С каждым использованием пригодность такого стекла падает.
Пластик – полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон и другие.
Металлы – нержавеющая сталь, так и титан, так как эти вещества химически инертны и обладают высоким отрицательным поверхностным зарядом.


Клетки прикрепляются к поверхности за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Этого можно достичь химической обработкой окисляющими агентами или физическими воздействиями (высоковольтным разрядом, ультрафиолетовым светом, бомбардировкой высокоэнергетическими электронами).


Продолжение: Системы культивирования клеток



Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей