Говорящее мерцание природы

31.05.200634880

Черное море. Теплая августовская ночь. Юная красотка грациозно входит в воду, ее силуэт вспыхивает восхитительным ореолом искр. Скажи ей, что это ее окружили мириады светящихся простейших, она, скорее всего, рванет к берегу, позабыв про грациозность. А вспененное море продолжит светиться, медленно угасая.


Фейерверк устроили светящиеся одноклеточные микроорганизмы, которые ярко разгораются в ответ на физическое раздражение, а потом уменьшают выброс фотонов. В морях и океанах живет масса светящихся существ, в свое время вызвавших глубокую задумчивость великого Дарвина. В его «Происхождении видов» даже появилась глава «Частные трудности теории естественного отбора». Дарвин не смог объяснить с точки зрения естественного отбора происхождение органов, вызывающих свечение у рыб.


Ученые, быстро разобравшиеся, что свечение вызывает белок люцифераза, пока далеко не во всех случаях могут объяснить, зачем это нужно природе.


Свет у рыб, по мнению биологов, может служить приманкой для особей противоположного пола. Доказано также, что, например, гигантские кальмары с помощью светящихся бактерий спасаются от кашалотов: кашалот атакует кальмара из глубины, когда на него от этого кальмара падает тень. Но светящиеся бактерии имитируют свечение Луны, и тень, с точки зрения кашалота, исчезает.


Красота и загадочность биолюминесценции привлекала многих ученых, но лишь сравнительно недавно знания о ее природе стали использовать на практике. Оказалось, что гены светящихся бактерий могут отлично работать в высокочувствительных биосенсорах, применяемых для выявления многих токсинов.


Жаль, что повар не дожил


В природе насчитывается более 700 биолюминесцентных видов организмов. Большинство светящихся организмов – морские. Наземных – светлячков, жуков, комаров и бактерий – намного меньше. Одни светятся постоянно, другие испускают короткие вспышки в ответ на физическое или химическое раздражение.


Наблюдая это свойство организмов, ученые давно подумывали, как его можно использовать. Понятно, что люцифераза могла стать отличным сигналом в методах анализа, причем сигналом, видимым человеческому глазу – в отличие от существующих методов. Сначала из светящихся организмов просто выделяли люциферазу и использовали ее в опытах, к примеру, для измерения АТФ (аденозинтрифосфата, энергетической молекулы). И лишь много позже, когда были секвенированы геномы многих организмов, стали заниматься созданием генно-инженерных конструкций, которые можно было использовать в качестве биосенсоров. Хотя первые прототипы появились еще до расшифровки геномов.


«В середине восьмидесятых мне пришла в голову мысль, что можно попробовать создать биосенсор, который будет светом сигнализировать об угрозе для ДНК», – рассказывает руководитель группы молекулярной генетики ГосНИИгенетики профессор Геннадий Завильгельский.


Такой биосенсор можно было сделать, частично скопировав механизм защиты клетки и добавив к конструкции «светящийся элемент». За миллионы лет клетка научилась достаточно эффективно справляться с посягательствами на свою жизнь и здоровье. В ходе эволюции у нее сложилась сложная система механизмов реакции на угрозы. Самые главные из них четыре – угроза разрушения ДНК, белков, мембран и окислительный стресс. К примеру, клетке угрожает токсин, который может нарушить святая святых – ее ДНК. Это может быть радиоактивное или химическое вещество. Этот токсин проникает в клетку, но там его поджидает специальный белок, который распознает именно те токсины, которые будут атаковать ДНК.


Белок связывается с токсином, в результате чего запускается синтез веществ, которые будут защищать ДНК. В норме (когда токсин не угрожает клетке) белок блокирует синтез этих веществ, потому что клетке совершенно незачем тратить силы на их производство без надобности. Белок – этакая рука, сдерживающая натянутую тетиву, которая может запустить синтез. По-научному «рука» называется репрессором, а «тетива» – промотором. Промотор, который задействован в механизме защиты ДНК, прозвали SOS-промотором. Для биосенсора нужна именно эта «двойка», которая будет узнавать конкретный токсин. Но в биосенсоре она будет запускать уже не защиту клетки, а свечение. И для этого нужно поставить рядом с ней гены, кодирующие синтез люциферазы и питательного субстрата для нее (lux-гены, которые еще называют репортером).


Если механизм защиты ДНК есть в любой клетке, то «репортера» нужно было извлечь у светящихся бактерий. Ученые попросили своих коллег из Института биофизики РАН, которые много лет изучали морские светящиеся бактерии и создали прекрасную коллекцию, прислать им штамм одной из таких бактерий – Vibrio fischeri. «Из него мы каким-то чудом, как я сейчас понимаю (ведь тогда еще геномы не были секвенированы), выделили хромосому, разрезали ее на куски и стали клонировать их», – вспоминает Завильгельский. Из десяти тысяч клонов удалось получить лишь два, которые светились.


Сейчас уже есть стандартная процедура создания подобных генно-инженерных конструкций. Основой для них служит плазмида бактерии Escherichia coli. Напомним, что информация о ее геноме содержится в хромосоме и в плазмидах. Из бактерии достают плазмиду, «вырезают» из нее лишние гены, чтобы «вставить» нужные, а именно гены-репортер и «двойку» (промотор с репрессором). Впрочем, репрессор нужен лишь тогда, когда его нет в Escherichia, в которую эту гибридную плазмиду будут вставлять. В частности, репрессор для SOS-промотора в ней есть.


Затем готовые бактерии культивируют – наращивают в специальных питательных средах. Потом высушивают специальным образом и помещают в маленькие запаянные ампулы. Стоит отметить, что в лаборатории Завильгельского особая методика культивирования клеток и подготовки к высушиванию, о которой ученые не распространяются.


После создания биосенсора на угрозу ДНК в лаборатории Завильгельского сделали биосенсор, определяющий мышьяк: нужные гены взяли у бактерии, у которой на него есть «нюх», поскольку она живет в местах, где часто с ним встречается.


[lib]luciferase1.jpg[/lib]

Ах, как кстати были бы эти биосенсоры в эпоху ядов и отравлений! К примеру, захотела бы коронованная особа проверить, не добавил ли какой недоброжелатель в ее бокал мышьяку. Взяли бы ампулку с биосенсором, растворили порошок в специальной питательной среде и капнули бы в эту смесь каплю бургундского. Если через пятнадцать минут засветится, значит, в пробе есть мышьяк. Королю такой информации, может, и достаточно, но для пытливого исследователя было бы важно знать, какую же дозу мышьяка подсыпал злодей. Поэтому он поместил бы пробирку с образцом в прибор-люминометр, который определяет интенсивность свечения, коррелирующую с соответствующей концентрацией яда. Злодею, конечно же, отрубили бы голову, но хоть повар бы не рисковал, всякий раз проверяя королевские блюда на безопасность.


Космонавтам и молочникам


«После создания биосенсора по определению мышьяка мы, как говорится, пошли вразнос, – шутит Завильгельский. – К тому же появилась методика, которая позволяла вытаскивать из плазмид многие гены и клонировать их».


[lib]luciferase2.jpg[/lib]К этому времени в лаборатории Завильгельского детально исследовали и определили нуклеотидную последовательность lux-генов единственной наземной светящейся бактерии – Photorhabdus luminescens. И все биосенсоры стали делать, забирая «светящийся элемент» именно из них. Завильгельский считает, что lux-гены Photorhabdus удобнее для использования в биосенсорах. По его словам, морские бактерии более капризны. Их люцифераза плохо переносит температуру выше 30 градусов, с ней работать тяжелее. К тому же у Photorhabdus так замечательно расположены гены, кодирующие синтез люциферазы и питательного субстрата для нее, – они рядышком, поэтому их очень удобно «вырезать».


Ученые сделали биосенсоры, которые сигнализируют об угрозе разрушения белков, мембранных липидов, реагируют на окислительный стресс, антибиотики ампициллинового и тетрациклинового рядов, ртуть, кадмий. Используя новейшие знания о системах жизнедеятельности бактерий, они создали биосенсор, который определяет состояние, называемое «кворум сенсинг» (необходимое множество), по веществу, с помощью которого бактерии общаются между собой. Появление такого вещества говорит о том, что бактерий накопилось достаточно, чтобы начинать атаку на организм.


Несколько лет назад в лабораторию приехали специалисты из Роскосмоса. Они спросили, можно ли сделать удобный и эффективный тест на гептил – ракетное топливо, которое неизбежно «удобряет» землю и воду в районах космодромов. (Это вещество накапливается, испаряется и вредно влияет на все живое). «Боюсь, что нет, – ответил Геннадий Завильгельский. Он не знал, существуют ли такие бактерии, у которых "нюх" на гептил. – Но попробовать можем». Намаялись с этими опытами. Ни бактерии такой не нашли, ни другие опыты не помогали. Отчаявшись, ученые стали исследовать почву с гептилом на всех своих биосенсорах. И вдруг одна проба засветилась. На том биосенсоре, что определяет окислительный стресс. «Я сначала удивился, но потом понял: гептил – настолько сильный восстановитель кислорода воздуха, что он создает перекись водорода, которая проникает в клетку и "открывает" промотор окислительного стресса», – продолжает рассказ Завильгельский.


Роскосмос начал финансировать отработку методики и ее патентование. На прошлой неделе специалисты Байконура приезжали за образцами биосенсоров, чтобы начать их испытывать на месте. «Этот заказ от Роскосмоса, собственно, и подтолкнул нас к мысли о том, что можно коммерциализовать наши технологии, – говорит гендиректор специально созданной компании "Гентех"' и научный сотрудник лаборатории Завильгельского Илья Манухов. – Пока мы активно не занимаемся маркетингом, но чувствуем некий точечный интерес разных сфер». К примеру, приезжали специалисты крупной молочной компании.


Молочникам очень важна проверка сырого молока на антибиотики. Почему? Антибиотиками могут кормить заболевших коров, и тогда эти антибиотики попадут в молоко. А это плохо. Во-первых, такое молоко не поддается специальному заквашиванию для приготовления кисломолочных продуктов. Во-вторых, в составе молочных продуктов антибиотики попадают в организм человека, накапливаются в нем, что в дальнейшем может привести к невосприимчивости человека к антибиотикам. Особенно это опасно для детей. Антибиотики могут попасть в молоко не только от коровы, но и от хитрого водителя, который в жаркие дни может кинуть пачку в цистерну, чтобы молоко не скисло, если ему вздумалось пару часиков вздремнуть на сеновале.


Лаборатория работает и с одной из фармацевтических компаний, проверяя на безопасность препараты на основе вытяжек из растений. Не будут ли они разрушительны для ДНК клетки, ее белков или мембран, не будут ли подвергать ее окислительному стрессу. Часто биосенсоры используются в научных целях. К примеру, академик Владимир Скулачев в поисках пилюли для почти вечной жизни синтезирует молекулы с антиоксидантными свойствами, которые будут бороться с ядовитыми активными формами кислорода, и проверяет их с помощью биосенсоров Завильгельского.


Созданные учеными биосенсоры можно использовать во многих сферах – экологии (для определения, к примеру, тяжелых металлов и других вредных веществ в почве и воде), пищевой промышленности (например, для распознавания антибиотиков), фармакологии (биосенсор можно использовать, исследуя на безопасность многочисленные химические соединения), косметологии (исследования на безопасность и определение концентрации антиоксидантов). Авторы технологии утверждают, что она может стать более быстрой, более дешевой и точной альтернативой применяемым сейчас методам. Существуют весьма дорогостоящие методы анализа с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии, бактериальные методы длительного выращивания культур в специальных средах.


Есть близкая американская технология «Микротокс», основанная на использовании биолюминесцентных морских бактерий, но метод московских ученых гораздо точнее и чувствительнее. Дело в том, что «Микротокс» базируется на обратном эффекте: тушении биолюминесценции клеток в присутствии токсина, а технология Завильгельского использует процесс возникновения свечения, что значительно чувствительнее для клеток (пороговые концентрации токсинов на несколько порядков ниже по сравнению с таковыми в «Микротокс»-тесте). К тому же «Микротокс» не может опознать конкретный токсин: он просто говорит, что что-то токсичное в исследуемой пробе есть.


Светящийся цветочек


Проект биосенсоров для определения токсинов участвует в экспертовском Конкурсе русских инноваций 2006 года и уже вышел в финал. В этом году в рамках конкурса проводится еще один – конкурс студенческих бизнес-планов, написанных для инновационных проектов, участвующих во «взрослом» конкурсе. Такой бизнес-план студенты написали и для проекта коммерциализации биосенсоров. Они сочли его довольно перспективным, обещающим хорошие рынки сбыта и окупаемость в течение трех лет и весьма привлекательную прибыль после. Конечно, план далеко не совершенен, но он может стать отправной точкой для дальнейшей работы. Ученые и такого плана, как правило, составить не могут. Да и не их это дело. Илья Манухов признает, что пока они живут грантами и нерегулярными заказами, об инновационных менеджерах они и не помышляют: денег на них нет. «Вот, может, студенты подрастут и согласятся с нами работать», – говорит он. Инвесторов ученые побаиваются, да и толком не знают, где их искать и как договариваться. Но, может статься, молодые менеджеры смогут убедить и разработчиков, и инвесторов в успехе нового дела.


Пока же ученые занимаются своими научными делами. Сейчас у них разработано 15 типов биосенсоров, а их может быть гораздо больше. По словам Геннадия Завильгельского, в клетке еще есть масса механизмов, которые можно использовать в биосенсорах. Поскольку коммерческим продуктом являются не только биосенсоры, но и приборы-люминометры, которые измеряют интенсивность свечения, приходится работать и над ними. Дело в том, что ученых не устраивают стандартные люминометры, поэтому по договору над усовершенствованием приборов трудятся профильные специалисты. «Нам нужно, чтобы наш прибор был более компактным, более чувствительным и термостатированным, чтобы в кюветах и пробирках сохранялась определенная температура – это важно для биосенсоров, – говорит Манухов. – Прибор должен быть многоканальным, чтобы одновременно можно было проводить измерения на группе биосенсоров». К примеру, помещают в кювету на 96 проб все биосенсоры плюс контрольные пробы, капают в них, скажем, молоко, вставляют в люминометр, который и отмечает, что в такой-то пробе есть антибиотик, в такой-то мышьяк, зато нет гептила. Еще желательно, чтобы прибор мог работать в полевых условиях. А для этого подошли бы биочипы.


«Это очень непростая задача, – признает Завильгельский. – Мы над ней работаем вместе со специалистами Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, которые делают чипы на основе ДНК и белков. Клетку посадить на чип очень сложно, она же должна быть живая. Ей нужны воздух, пища. Мы пробовали, но она на чипе пока плохо себя чувствует, поэтому и работает неважно». Однако затеи этой ученые не бросают. Завильгельский говорит, что уже есть ряд идей, как устранить недостатки.


У Манухова еще одна мечта – светящиеся растения. «Это классная штука, – говорит он. – Если биосенсоры уже начинают производить, по большей части для исследовательских целей, то о таких растениях я еще не слышал. Их в принципе можно сконструировать с генами, синтезирующими различные флюоресцирующие белки. И они могут светить самыми разными цветами». Эти гены можно выделить, к примеру, из кораллов или медуз.


Такие светящиеся растения можно будет высаживать вокруг космодромов или металлургических комбинатов. Можно использовать и в сельском хозяйстве – растения будут показывать концентрацию гербицидов и пестицидов. Вот на этот проект ученым точно потребуется инвестор, поскольку здесь нужно начинать практически с нуля. Но этот проект может стать едва ли не более коммерчески привлекательным, чем биосенсоры. Вероятно, не только крупные потребители, но и дачники захотят иметь у себя на участке светящийся цветочек.


Галина Костина, «Эксперт» №20(514), 29 мая 2006


Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей