Флуоресцентная визуализация: вглядываясь в клетки

25.01.200760490

Появление возможности метить отдельные белки флуоресцирующими молекулами и таким образом заглядывать внутрь клеток произвело революцию в мире молекулярной биологии. Новые достижения в области флуоресцентной визуализации, описанные в данном фото-эссе, позволяют ученым заглядывать в клетки как никогда глубоко.





















1) Флуоресцентные метки разработаны для огромного количества белков. Однако многие из них имеют недостатки: они легко теряют яркость или не обеспечивают достаточного количества цветов для одновременного изучения нескольких белков. Новый тип флуоресцентных меток, представляющих собой нанокристаллы, или квантовые точки, может стать решением этой проблемы. Ученые могут создавать квантовые точки всех цветов радуги. А благодаря тому, что квантовые точки разных цветов возбуждаются световыми волнами одной длины, их можно использовать для одновременной визуализации большого количества белковых молекул.



На рисунке изображен поперечный срез стенки тонкой кишки мыши, помеченный красными и зелеными квантовыми точками, специфичными к белкам двух типов, и красителем, окрашивающим клеточные ядра в голубой цвет.
2) На этом рисунке изображен срез ткани мышиной почки, также помеченный красными и зелеными квантовыми точками, специфичными к белкам двух типов, и красителем, придающим ядрам голубой оттенок.
3) Флуоресцентные метки обычно прикрепляются к белкам с помощью крупных молекул антител, что может нарушать нормальное функционирование белков. Кроме того, формирующиеся при этом связи обычно нестабильны. В новом методе прикрепления меток, разработанном доцентом Массачусетского технологического института Алисой Тинг (Alice Ting), используются «переходники» меньшего размера, обеспечивающие более прочное соединение. На первом этапе ученые генетически модифицируют белок-мишень, прикрепляя к нему специфическую метку. После этого изготавливаются флуоресцирующие метки и добавляется фермент, соединяющий обе метки между собой. Формирующаяся при этом связь исключительно прочна и позволяет исследователям отслеживать перемещение отдельных белковых молекул по объему клетки в течение длительного времени.



На рисунке видны генетически модифицированные клетки, экспрессирующие белок, светящийся голубым светом. Этот голубой белок по периметру всей клетки помечен красной флуоресцентной меткой.
4) Несмотря на то, что два описанных выше метода позволяют взглянуть на содержащиеся в клетке молекулы, они не способны визуализировать объекты, размер которых меньше 300 нанометров. По словам Ксяовей Жуанг (Xiaowei Zhuang) из Гарвардского университета, возможность различить две белковых молекулы размером по пять нанометров каждая открыла бы совершенно новые возможности наблюдения за происходящим внутри клетки. Жуанг метит белки с помощью специально разработанных флуоресцирующих меток, которые мгновенно активируются и инактивируются при помощи света. После этого она одномоментно активирует только несколько расположенных на довольно большом расстоянии меток. Это позволяет отличать молекулы друг от друга под световым микроскопом и четко идентифицировать их местонахождение. Процесс повторяется неоднократно, при этом каждый раз идентифицируется локализация новых меток. После это полученные изображения комбинируются для получения полной картины. По словам Жуанг, такая обладающая высоким разрешением методика обеспечивает более детальное выявление взаимодействий молекул в клетке.



На этом рисунке представлены циркулярные филаменты (микроволокна) из ДНК-связывающих белков, визуализированные с помощью традиционного широкопольного микроскопа (желтоватые пятнышки) и методом Жуанг, выдающим четкие кольца пиков, отражающих локализацию меток.
5) Традиционные системы визуализации клеток обеспечивают получение их моментальных изображений в фиксированные моменты времени. Автоматический микроскоп, созданный Стивом Финкбейнером (Steve Finkbeiner) из университета штата Калифорния, может изменить устоявшееся положение вещей. Микроскоп в течение нескольких часов или даже дней делает серии фотографий клеток, растущих на плоской поверхности. Специальное программное обеспечение идентифицирует меченые флуоресцентными метками клетки-мишени и отслеживает происходящие в них изменения.



На представленном рисунке нейрон крысы, несущей мутацию, аналогичную мутации, являющейся причиной болезни Хантингтона у человека, окрашен в желтый цвет, а комплекс специфичных белков – в красный. Голубые окружности – это ядра клеток глии, поддерживающих функционирование нервной ткани.
6) Эти фотографии выбраны из серии, отснятой в течение 60 часов, и демонстрируют процесс гибели клетки, отмеченной зеленой стрелкой.
7) Совсем незначительные вариации в строении мозга могут лежать в основе развития шизофрении, аутизма и других расстройств нервной системы. Методы идентификации этих минимальных дефектов должны обладать высокой степенью разрешения и способностью охватывать обширные зоны ткани, причем в трех измерениях. К сожалению, большинство существующих методов визуализации с высоким разрешением можно использовать только для изучения небольших зон мозга.



Недавние разработки в области автоматизированной микроскопии способны преодолеть подобные трудности. Группа Марка Эллисмана (Mark Ellisman) из Калифорнийского университета разработала микроскоп, позволяющий получать серии трехмерных изображений среза ткани, слегка перемещаемого между снимками с помощью моторизованного высокоточного компьтерного предметного столика. Специальная программа комбинирует получившиеся изображения в единое целое.



На этом рисунке поперечный срез крысиного мозжечка окрашен флуоресцентными красителями трех типов с целью визуализации как индивидуальных клеток, так и послойной структуры ткани.
8) Это рисунок демонстрирует максимально возможное при описанном выше методе увеличение. Изображение состоит из 43500 отдельных снимков и занимает несколько гигабайт памяти. На его создание потрачено более 20 часов.
9) Этот рисунок также демонстрирует максимальное увеличение поперечного среза крысиного мозжечка, окрашенного флуоресцентными красителями трех типов для идентификации индивидуальных клеток и послойной структуры ткани.

Евгения Рябцева


Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/ по материалам TechnologyReview.


Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей