Критерии оценки аллергенности генетически модифицированных культур

18.02.200880320
Критерии оценки аллергенности генетически модифицированных культур

Генетически модифицированные (ГМ) культуры призваны улучшить качество пищи, повысить урожайность и уменьшить потребность в пестицидах. Безопасность ГМ культур скрупулезно проверяется по многим параметрам, в том числе по аллергенности. Как выяснилось, не все методы оценки аллергенности имеют достаточное научное обоснование. Полученные недавно оценки аллергенности ряда трансгенных культур выявили несостоятельность некоторых критериев.


Введение

ГМ культуры проходят тщательную проверку на безопасность перед тем, как попасть в продажу. Несмотря на это, общественность продолжает волновать вопрос о потенциальной аллергенности ГМ культур. Производители пищевых продуктов и регулирующие структуры, ответственные за безопасность еды, фокусируют внимание на защите людей с пищевой аллергией от случайного воздействия аллергенов. Одной из задач пищевой индустрии является предотвращение контаминации основными пищевыми аллергенами (такими как арахис, молоко, яйца, пшеница) тех продуктов, которые не должны их содержать. Оценка безопасности ГМ культур призвана предотвратить перенос гена, кодирующего аллергенный белок, из любого источника в генетически изменяемую культуру, согласно определению (приложение 1), данному в 2003 году Комиссией по безопасности продовольствия при Продовольственной и сельскохозяйственной организации и Всемирной организации здравоохранения (КБП при ПСО/ВОЗ), (Codex Alimentarius Commission under Food and Agricultural Organization/World Health Organization (FAO/WHO)).

Риски, связанные с пищевой аллергией, следует рассматривать в перспективе. Пищевая аллергия встречается, в среднем, у 6% маленьких детей и у 3% взрослых. Многие пищевые продукты, необходимые для здорового рациона (такие как рыба, арахис, креветки, киви и т.д.), сами по себе аллергенны. Несмотря на то, что у 1% населения они могут вызывать аллергические реакции, никто не стремиться лишать этих продуктов остальные 99%. Вместо этого покупателей с пищевой аллергией предупреждают о наличии аллергенов в продуктах с помощью маркировки продуктов. Подобные доводы можно привести в защиту новых сортов, полученных для борьбы с недоеданием в развивающихся странах, вне зависимости от того, вывели их с помощью обычной селекции или модифицировали обычные культуры.

К настоящему времени нет данных о том, что какая-нибудь одобренная и выращиваемая в коммерческих целях ГМ культура вызывает аллергические реакции, связанные с трансгенным аллергенным белком, или что при культивировании на протяжении нескольких лет ГМ культуры повышается ее аллергенность. Однако возможность переноса аллергена в ГМ культуру продемонстрировали в 1996 году на примере сои с повышенным содержанием метионина (сконструированная для улучшения качества кормов) за счёт гена, кодирующего 2S альбумин из бразильского ореха. Хотя ранее не было известно об аллергенности этого белка, эксперименты на связывание IgE из сывороток людей с аллергией на бразильский орех и кожные контактные пробы (ККП), (skin prick test (SPT)) [1] на 2S альбумин из бразильского ореха дали положительные результаты (исследование проводилось для компании-разработчика Pioneer Hi-Bred International, Inc. (Johnston, IA, USA)). Теперь этот белок известен как основной аллерген бразильского ореха. Несмотря на то, что полученный сорт трансгенной сои разрабатывался исключительно для питания скота, продукт запретили из-за очевидного риска.

Инцидент послужил толчком к разработке системы для предпродажной оценки аллергенности ГМ культур и продемонстрировал, что подходящие тесты могут предотвратить перенос гена, кодирующего потенциально опасный белок. Очевидно, что невозможно предотвратить все потенциальные случаи аллергических реакций на нововведенный белок, но научно разработанные протоколы оценки безопасности ГМ культур позволяют свести риск возникновения аллергических реакций к минимуму. Некоторые ученые и регулирующие организации требуют проведения постпродажного мониторинга ГМ культур для выявления новых аллергических реакций на продукт. В документе, принятом КБП, подчёркивается необходимость в эффективных предпродажных оценках ГМ культур в качестве оптимального способа защиты потребителей.

Ниже обсуждается научная обоснованность протоколов для предпродажной оценки аллергенности ГМ культур. Показано, как три уже используемых, но недостаточно подходящих теста, могут блокировать дальнейшую разработку потенциально полезных ГМ культур.


Эволюция руководств по оценке аллергенности ГМ культур

Потребность в усовершенствовании нормативов появляется с накоплением знаний о методах оценки аллергенности ГМ культур и о самих аллергенах. Несколько основных пунктов нормативов остались без кардинальных изменений.

Все варианты нормативов, начиная с их первого принятия в 1996 году Международным советом по пищевым биотехнологиям (МСПБ) (International Food Biotechnology Council (IFBC, Washington, DC)), совместно с Международным институтом естественных наук (МИЕН) (International Life Sciences Institute (ILSI, Washington, DC), пересмотренных затем в 2001 году Продовольственной и сельскохозяйственной организацией (ПСО) при Организации объединенных наций (ООН) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (Food and Agriculture Organization/World Health Organization (FAO/WHO)), и заканчивая последним вариантом, принятым КБП (Codex Alimentarius Commission) в 2003 году, единогласны по нескольким пунктам.

Во-первых, все руководства запрещают введение известных аллергенов в генетически изменяемые культуры, поскольку здоровье аллергиков ставится под угрозу. Если источником трансгена является заведомо аллергенный продукт или если его последовательность гомологична генам известных аллергенов, требуется провести тесты на связывание переносимого белка с IgE из сывороток людей, имеющих аллергические реакции на источник белка или на последовательности выявленных аллергенов. Результаты тестов позволяют определить, является ли продукт переносимого гена неизвестным до сих пор аллергеном из известного аллергенного источника или антитела IgE на известные аллергены перекрестно реагируют на гомологичный трансгенный белок.

Во-вторых, все три руководства включают анализ устойчивости переносимого белка к расщеплению пепсином, поскольку вероятность индукции серьёзных системных симптомов белками, устойчивыми к протеолизу пепсином, высока.

В основе первых двух руководств по оценке риска возникновения аллергии лежит логика «дерева» решений (decision tree) [2]. Согласно нормативам, утвержденным МСПБ-МИЕН, проведение клинических испытаний, а именно кожных контактных проб (ККП) и двойного слепого провокационного теста с использованием плацебо (ДСПТИП)[3] (double-blind placebo-controlled food challenges (DBPCFC)), требовалось даже при отрицательных результатах IgE теста с белком из аллергенного источника, в случае гомологичности участка из 8 аминокислот проверяемого белка с известным аллергеном. В рекомендациях, данных ПСО/ВОЗ, требование проведения клинических испытаний охарактеризовано как непрактичное и даже в большинстве случаев не этичное. Вместо этого для демонстрации отсутствия риска предлагается проведение IgE теста с отрицательными контролями или ККП в некоторых случаях, но никак не провокационных тестов (воздействуя на организм больного разными аллергенами, выявляют тот из них, который вызывает аллергическую реакцию у пациента).

Сокращение минимального участка для поиска гомологии при оценке риска перекрестной реакции с известными аллергенами с 8 до 6 аминокислот – ещё одно изменение, внесенное ПСО/ВОЗ в нормативы МСПБ-МИЕН. Требование направленного скрининга широкого диапазона сывороток, взятых у пациентов с аллергиями на источник гена и на относящиеся к нему аллергены, для выявления потенциальной перекрестной реакции c ними IgE и использование экспериментов на животных – два дополнительных пункта, веденные в рекомендации 2001 года ПСО/ВОЗ. Направленный скрининг сывороток рекомендовался даже при отсутствии значительной гомологии между трансгенным белком и известным аллергеном и при отрицательных результатах специфического анализа сывороток (взятых у пациентов с аллергией к источнику трансгена или к гомологичным ему аллергенам). Эксперименты на животных считались обязательными, несмотря на отсутствие соответствия между моделями, предсказывающими риск сенсибилизации у людей и у животных.

В документе, разработанном КБП, оценка риска аллергенности ГМ культур основывается на принципе перевеса совокупности доказательств в пользу «за» или «против». Поскольку логика предыдущих нормативов оказалась непригодной для тех случаев, когда невозможно сделать вывод ни по одному из отдельных критериев, т.е. нельзя перейти от одного заключения к другому (последовательная схема не работает), а для окончательного вывода необходима вся совокупная информация. КБП включила в нормативы только научно обоснованные методы оценки, исключив из предыдущего документа требование проведения экспериментов на животных и направленного скрининга сывороток. Вместо требования проверки перекрестной реакции IgE для слишком коротких участков гомологии трансгена с известными аллергенами, КБП порекомендовала выбирать аллергены для теста только с 35% идентичностью на 80-ти аминокислотном фрагменте трансгена. Не все регулирующие учреждения одобрили эти нововведения. В отдельных случаях регулирующие органы продолжают принимать окончательное решение о безопасности ГМ культуры на основании тех требований, от которых уже отказались (моделей на животных и коротких пептидов для поиска гомологии в тестах на перекрестную реакцию).


Протоколы оценки

В этом разделе внимание фокусируется на научном аспекте протоколов оценки аллергенности ГМ культур и иллюстрируется несостоятельность необоснованных требований оценки, принятых ПСО/ВОЗ и КБП. На рисунке 1 показана схема оценки риска возникновения пищевой аллергии, данная КБП, и основанная на принципе перевеса совокупности доказательств в пользу «за» или «против».



Рисунок 1. Схематическая интерпретация оценки аллергенности по совокупности доказательств, установленная КБП. Четыре основных пункта документа представлены в виде четырех треугольников, верхние углы которых соответствуют максимальным рискам. Весомость доказательства по каждому пункту определяется факторами, указанными в оранжевых прямоугольниках. Несовершенство современных методов, используемых для отличия аллергенных белков от неаллергенных, делает научную интерпретацию результатов особенно актуальной для принятия взвешенного заключения об аллергенности нового продукта.


Источник гена

Процесс оценки начинается с изучения источника гена. Для генов, взятых из известных аллергенных продуктов (таких как арахис, фундук, куриные яйца или коровье молоко), респираторных аллергенов (пыльца трав, берёзы и клещи из домашней пыли) или из контактных аллергенов (латекс), обязательна проверка на перекрестную реактивность продукта нового гена с IgE из сыворотки пациентов с аллергиями на данный источник. При выборе сывороток необходимо учитывать возраст и место проживания доноров, т.к. эти факторы влияют на связывание IgE (Приложение 2), а также следует рационально определить количество исследуемых образцов.

Провести статистически значимые исследования весьма проблематично, когда гены берут из источников, редко вызывающих аллергию, - трудно найти достаточное количество доноров сыворотки. С другой стороны, это означает малое количество индивидуумов в популяции, подверженных риску аллергических реакций на новый белок в случае его аллергенности. В таких ситуациях важнее обращать внимание на специфичность анализов и на клинически подтвержденную значимость источника аллергена.


Биоинформатика

Аминокислотные последовательности всех переносимых белков, вне зависимости от источника, подлежат обязательному сравнению с известными белковыми аллергенами при помощи алгоритмов FASTA или BLAST, что позволяет прогнозировать возникновение перекрестных аллергических реакций на новые белки при высокой гомологии между сравниваемыми участками. При идентичности последовательностей, превышающей 70%, вероятность появления перекрестной аллергии высока и риск её развития сравним с известными данными для гомологичного аллергена. Идентичность гомологичных участков в пределах 50 – 70% представляет собой среднюю вероятность возникновения перекрестной аллергии. При идентичности меньше 50% риск развития перекрестной аллергии не значителен. Установленная ПСО/ВОЗ и КБП минимальная значимая величина гомологии - 35% идентичности на любом сегменте переносимого белка, превышающем 80 аминокислот, направлена на выявление консервативных функциональных мотивов, способных принимать структуры эпитопов исследуемого белка. Анализ связывания IgE обязателен для белков с идентичностью гомологичных участков, превышающей 35%.

Подозрения о том, что белки из предположительно аллергенных источников с 35-50% идентичностью к переносимым белкам способны индуцировать перекрестную реакцию, оправдались только для немногих белков. До сих пор не зарегистрировано ни одного случая перекрестной аллергии для белков с 35% идентичностью на участках, превышающих 80 аминокислот, что указывает на чрезмерную строгость критерия. По мнению авторов, существует два способа приблизить критерий к реальности. Можно искать белки-претенденты на перекрестную реактивность по гомологии со всей последовательностью нового белка. Другой вариант - настаивать на проведении дополнительных исследований только при идентичности 80-ти аминокислотного участка переносимого белка с аллергенным белком, превышающей 50%, поскольку для такой степени гомологии зафиксированы случаи слабой перекрестной реактивности с сыворотками пациентов, страдающих аллергией на источник обоих белков.

Для некоторых аллергенов, выявленных с помощью поиска гомологии, может отсутствовать информация об их способности вызывать аллергию. Дополнительные данные о выявленном белке следует искать в базах данных по аллергенам, например в AllergenOnline – на сегодняшний день единственной рецензируемой базе данных, или в базе данных Национального центра биотехнологической информации США, National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA, ).

Несмотря на отсутствие публикаций, обосновывающих требование проверки перекрестной реактивности найденных белков с 35% идентичностью на участке из 80 аминокислот к переносимому белку или на 50% гомологией ко всей его последовательности, – это уже прогресс по сравнению с анализом аллергенности белков с гомологией на фрагментах из 6-8 аминокислот. От такого подхода следует отказаться на основании переизбытка ложно-положительных результатов. Гомологичность на 6-мерном пептиде предсказывает аллергенность двух третей всех белков в базе данных по белкам Swiss-Prot и более 40% генома человека! Очевидна абсурдность требования поиска гомологии для крошечных фрагментов (из 6-8 аминокислот) в качестве критерия оценки аллергенности переносимого белка, но до сих пор регулирующие органы временами требуют проверки белков с гомологией на 6-мерных пептидах (приложение 3).


Связывание IgE

Оценка белков из аллергенных источников или белков с 35% гомологией на 80-ти аминокислотном участке к известным аллергенам по анализу связывания IgE даёт достоверные результаты при правильно подобранных позитивных и негативных контролях. Сыворотки для положительных контролей необходимо брать только у пациентов с диагностированной аллергией на источник гена или на аллерген, найденный по гомологии, и его источник. В качестве отрицательных контролей можно брать сыворотки людей, не страдающих аллергией, или у пациентов, имеющих аллергию на другие белки.

На интерпретацию результатов анализов сывороточного связывания IgE влияют такие факторы, как количество тестируемого белка в образце (чувствительность метода) и форма белка (мономерная, полимерная, наличие N- гликанов).

Ложноположительные результаты (без клинических проявлений) могут возникнуть из-за перекрестного взаимодействия IgE с растительными N- гликанами. Когда гликаны не существенны для функции белка, разработчикам следует удалять сайты гликозилирования из переносимого белка перед генетическим модифицированием. Эксперименты по IgE связыванию не следует проводить на сыворотках аллергиков с IgE, специфичными к углеводам, а пациентов отбирать с IgE против белков. Аллергенность гликозилированных трансгенных белков следует проверять альтернативными методами (например, по высвобождению базофилами гистамина в ответ на провокацию [4] аллергеном). Неоднозначные результаты IgE-тестов (например, при незначительном связывании IgE антителами антигенов в сыворотке аллергиков) также необходимо проверять с помощью ККП или провокационных тестов.


Стабильность в пепсине и превалирование переносимого белка

Устойчивость нового белка к протеолизу пепсином оценивается как фактор риска развития аллергии. Многие пищевые аллергены устойчивы к расщеплению пепсином, а большинство диетических белков легко перевариваются пепсином. Однако некоторые белки, не вызывающие пищевой аллергии, стабильны, а часть аллергенных белков, особенно тех, что индуцируют не сильное раздражение ротовой полости, лабильна. Пищевые аллергены из последней категории представлены в основном перекрестно реагирующими белками при первичной сенсибилизации на респираторные аллергены (например, пыльцу). Поэтому их не относят к основным пищевым аллергенам, и они не представляют угрозы для потребителей (если их количество в ГМ культуре невелико).

Некоторые очень стабильные белки, такие как тауматин-подобные белки (белки, обладающие сладким вкусом) из яблок и винограда, редко вызывают аллергию или провоцируют слабые реакции, а другие стабильные белки, такие как белки-переносчики жиров из разных источников, приводят к возникновению серьёзных системных симптомов. Некоторые аллергены меняют подверженность к протеолизу пепсином при сдвиге кислотности (pH) (например, при сдвиге pH с 2.5 до 2.75 тресковый парвальбумин становится более устойчив к расщеплению пепсином), поэтому анализ на стабильность белков в пепсине проводят при двух значениях pH: 1.2 и 2.0.

Избыток белка в пище - дополнительный фактор риска возникновения пищевой аллергии (аллергенные белки составляют более 1% от общего содержания белков в аллергеном продукте). Устойчивые к воздействию пепсином белки легче усваиваются организмом в неизменном виде, поэтому такие белки легче вызывают сенсибилизацию и являются первыми кандидатами в пищевые аллергены. Количество потребляемой пищи так же влияет на развитие аллергии – стабильные белки, присутствующие в небольших количествах, тоже могут быть аллергенными, если употребляются в избытке.


Критерии оценки аллергенности ГМ культур – «кто на вылет»?

Попытка научного обоснования критериев оценки аллергенности ГМ культур, входящих в нормативы первых двух редакций, продемонстрировала практическую непригодность некоторых из них, таких как поиск по гомологии по 6 аминокислотным фрагментам и направленный скрининг сывороток. Некоторые новые подходы тоже продемонстрировали недостаточную обоснованность.


Эндогенная аллергенность

При переносе трансгена в известную аллергенную культуру логично проследить за изменением эндогенной аллергенности продукта, что и предлагалось различными руководствами по оценке аллергенности ГМ культур. Но в документах не указывались допустимые нормы различий в аллергенности между ГМ и обычной культурой. Сравнение эндогенной аллергенности нескольких ГМ культур с их нетрансгенными аналогами по связыванию IgE из сывороток людей с аллергией на культуру-акцептор с трансгенным белком не выявило разницы между ГМ и их традиционными аналогами. Остается непонятным, как определять риск при наличии различий.

Сравнение по аллергенности десяти сортов ГМ сои (Roundup Ready, разработанных компанией Monsanto, St. Louis, MO, USA, устойчивых к гербициду Roundup этой же компании) и восьми разновидностей традиционной сои различными методами выявило 4-кратную разницу на всем диапазоне сортов сои (ГМ и обычных), но не обнаружило значительных различий между ГМ и традиционными сортами. Естественные сорта зерновых культур характеризуются широким диапазоном аллергенности. Неясно, почему надо предъявлять более строгие требования к ГМ культурам в отношении изменения эндогенной аллергенности, когда мы сталкиваемся с различной аллергенностью традиционных сортов. В целом, дискуссия на тему эндогенной аллергенности не имеет большого значения, т.к. люди с аллергией на какой-то продукт, скорее всего, стараются избегать его употребления (вне зависимости от того, ГМ это продукт или традиционный) для предотвращения аллергических реакций.

Несколько групп ученых всесторонне изучили различия в аллергенности у многих естественных (не ГМ) сортов яблок, по двум основным аллергенам: аллергену, ассоциированному с берёзовой пыльцой Mal-d1 и яблочному белку-переносчику жиров Mal-d3. Различия в аллергенности нашли по IgE-связыванию, IgE-ингибированию, по количественному подсчету аллергенов, по in vitro анализу высвобождения гистамина базофилами, по геномному полиморфизму, а также по ККП и по ДСПТИП. Между десятью сортами яблок обнаружили шестикратный разброс содержания белка Mal-d3. Диаметр воспаленного участка при ККП с концентрацией Mal-d3, соответствующей наибольшему его содержанию в яблоках сорта Старкинг (55 мг/г), втрое превышал диаметр воспаления, образовавшегося от пробы Mal-d3, соответствующей низкой концентрации в яблоках, например сорта Голден Делишес (10 мг/г). Максимальный разброс в содержании аллергенов (100-кратный) обнаружили при анализе содержания Mal-d3 и Mal-d1 аллергенов. В исследованиях на ККП и ДСПТИП нашли 10-кратные различия между отдельными сортами яблок. Подобные эксперименты проделали с несколькими немодифицированными сортами сои и получили широкий разброс аллергенности. Интересно, что содержание аллергенов в отдельных яблоках данного сорта одного урожая может различаться на порядок.

Подытоживая приведенные примеры, можно утверждать, что даже обычные (не ГМ) продукты существенно различаются по аллергенности. Перед тем, как требовать оценки изменений эндогенной аллергенности ГМ культур, необходимо определить пределы аллергенности для традиционных (не ГМ) культур. Несмотря на это, некоторые регулирующие органы интерпретируют нормативы настолько широко, что требуют оценивать изменения эндогенной аллергенности таких продуктов, для которых невозможно найти подходящих больных (с истинной аллергией) для полноценного исследования. (Приложение 4).

В особых случаях, когда есть основания предполагать увеличение количества эндогенных аллергенов в результате ГМ, необходимо обратить особое внимание на оценку аллергенности. Увеличение эндогенных аллергенов может произойти, когда, например, переносимым геном является активатор транскрипции или трансген помещен в кодирующую последовательность аллергена. Но такие события не могут остаться незамеченными разработчиком ГМ культуры, поскольку нормативами КБП требуется подробная молекулярная характеристика гена и его продукта, а так же функция кодируемого белка (Приложение 1).


Направленный скрининг сывороток

В рекомендациях ПСО/ВОЗ для направленного скрининга сывороток особо оговаривается, что если источником трансгена является растение класса однодольных, то для определения потенциально перекрестно-реагирующих аллергенов исследование следует проводить на 50 сыворотках, взятых у людей с аллергиями на разные растения того же класса (например, с аллергиями на кукурузу, рис, финики или на пыльцу трав). В нормативах КБП это требование сочли не обоснованным. Известно четыре семейства структурных белков (проламины, купины, профилины и Bet v 1 – подобные белки) – основных источников растительных пищевых аллергенов). Они перекрестно реагируют с аллергенами из других таксономических групп, вызывая яркие клинические симптомы аллергии. Клинически трудно бывает отличить перекрестную реактивность от сенсибилизации к нескольким аллергенам и от неспецифического связывания IgE (низкая аффинность или связывание с перекрестно реагирующими углеводными группами), поскольку клинически проявляемую реакцию редко измеряют. Перекрестную реактивность обычно определяют по степени реакции в ККП или непосредственно по связыванию IgE, хотя результаты этих тестов часто приводят к переоценке клинической реакции. Несмотря на то, что обоснованные анализы сывороток, взятых у людей с клинически выраженной аллергией на источник гена (или на гомологичный аллерген), могут оказаться полезными в определенных ситуациях, направленный масштабный скрининг сывороток не дает надёжных данных для оценки аллергенности.


Модели на животных

Согласно рекомендациям ПСО/ВОЗ, оценку аллергенности каждой новой ГМ культуры необходимо проверять на двух видах животных или использовать два пути сенсибилизации на одном виде. Эксперты признают, что предсказать аллергенность данного продукта для людей невозможно с помощью существующих моделей оценки аллергенности на животных. Некоторые ученые продолжают настаивать на проведении таких экспериментов для оценки безопасности ГМ культур, несмотря на то, что разные модели на животных дают противоречивые результаты при исследовании определенных белков. Принимая во внимание отсутствие коррелирующих данных между какой-либо моделью на животных и человеческой пищевой аллергией и сложность генетических предпосылок пищевой аллергии, польза от проведения экспериментов на животных для предсказания потенциальной аллергенности нового белка для людей представляется весьма сомнительной. Также остается непонятным, как скомбинировать результаты двух моделей на животных для предсказания риска аллергии на тестируемый продукт у людей. В исследовании, скоординированном МИЕН-Институтом здоровья и наук об окружающей среде (Вашингтон, Округ Колумбия, США), ILSI-Health and Environmental Sciences Institute (Washington, DC, US), и проведенном совместно несколькими лабораториями на нескольких линиях мышей (BALB/c, C3H/HeJ, A/J и BDF-1), оценивали связывание IgE и аллергические реакции на основные аллергены фундука (Ara h 1 и Ara h 2) и молока (бета-лактоглобулин) в сравнении с гипоаллергенными белками шпината (RUBISCO) и сои (липоксигеназы). Реакция на основные аллергены была даже слабее, чем на гипоаллергенные белки.

Авторы предлагают продолжить поиск адекватной экспериментальной модели на животных, но предостерегают от проверки аллергенности потенциальных продуктов на животных. Это мнение отражено и в рекомендациях, данных КБП.

Разработчики и регулирующие органы порой не могут решить, каким именно следовать рекомендациям. Неоднозначность ситуации проиллюстрирована двумя случаями, в которых разработчики ГМ культур оценивали потенциальную аллергенность на животных. В первом случае (приложение 5) результаты интерпретировали как подтверждающие аллерегнность ГМ культуры, а во втором (приложение 6) - как отсутствие риска аллергенности, несмотря на предпосылки к перекрестной реактивности на основании биоинформационного анализа. Научного обоснования сделанных выводов не было в обоих случаях.


Выводы

Современные нормативы оценки безопасности, описанные в КБП 2003года, основаны на научных знаниях и позволяют достаточно точно оценивать аллергенность ГМ культур по сравнению с традиционными сортами. Оценка безопасности, основанная на принципе перевеса совокупности доказательств в пользу «за» или «против», оказалась более подходящей, поскольку последовательная схема принятия решений («дерево решений») не учитывала многие исключения, существующие на каждом этапе оценочного процесса.

Ключевые моменты оценки по принципу перевеса совокупности доказательств проиллюстрированы на рисунке 1:

- Источник аллергена: известный аллерген или нет?
- Биоинформатика: поиск гомологии на участке длинной более 80 аминокислот с идентичностью, превышающей 35% (или 50% для всей последовательности переносимого белка).
- IgE-связывание: связывается ли переносимый белок антителами IgE?
- Анализ стабильности: устойчив ли трансгенный белок к расщеплению пепсином?
- Количество: превалирует ли переносимый белок в пище (и является ли термически стабильным)?

Процесс предпродажной оценки, разработанный КБП, представляет собой механизм для запрета потенциально аллергенных ГМ культур, как видно из случая с идентификацией 2S-альбумина из бразильского ореха, перенесенного в кукурузу, и амарантина, перенесенного в кукурузу (приложение 6). Оценка аллергенности защищает потребителей-аллергиков от возможных серьезных аллергических реакций, которые могли бы возникнуть при употреблении ими в пищу продуктов из аллергенных ГМ культур, и предотвращает дорогостоящий процесс отзыва из продажи опасной продукции во избежание дальнейших случаев аллергии.

Приведенные ниже критерии аллергенности не получили достаточного научного обоснования из-за их недостаточной информативности:

- Биоинформатика: поиск гомологии по коротким пептидам приводит к случайным ложно-положительным результатам.
- Модели на животных: подходят для изучения механизмов молекулярных процессов, но не для предсказания сенсибилизации человека на определенный продукт.
- Эндогенная аллергенность: недостаточно изучена изменчивость традиционных культур.
- Направленный скрининг сывороток: обилие ложно-положительных данных и низкая вероятность получения истинно-положительных результатов.

Требование проведения таких необоснованных экспериментов может привести к запрету безопасных и полезных продуктов, а также к ненужным дополнительным расходам на исследования. Использование неподходящих и необоснованных тестов (таких как модели на животных) может привести к одобрению продукта, представляющего опасность для аллергиков.

__________

[1] Кожные контактные пробы (ККП): на кожу пациента капают раствор аллергена и делают на месте капли царапину; если вещество вызывает аллергию, кожа под каплей распухает и краснеет.

[2] Логика «дерева решений» – последовательная схема принятия решений, когда каждое последующее решение зависит от исхода предыдущего или от экспериментальных результатов.

[3] ДСПТИП является частным случаем провокационных тестов и заключается в следующем: пациент съедает потенциально аллергенный продукт в небольших количествах повторно в возрастающих дозах (начиная с 125-500 мг с последующим удвоением дозы через каждые 15-60 минут). Для каждой порции определяют реакцию организма. Результат теста считают отрицательным, если дозу продукта в 10 гр пациент переносит без развития реакции; если же аллергическая реакция развивается после употребления меньших доз подозрительного продукта, тест считают положительным.

[4] Провокационные тесты заключаются в следующем: воздействуя на организм больного разными аллергенами, выявляют тот из них, на который у пациента есть реакция.


Приложение 1. Оценка риска ГМ культур.

КБП приняла в 2003 году нормативы для согласования странами мирового сообщества процесса предпродажной оценки опасности ГМ культур, поступающих на международный рынок. Одобренные нормативы необходимы для выработки странами мирового сообщества правил строгого контроля безопасности пищевых продуктов и для упрощения торговли. Все новые ГМ культуры проходят обязательную предпродажную оценку безопасности для выявления вредных преднамеренных или непреднамеренных изменений. В случае установленной опасности ГМ культуры нормативами требуется оценка риска и принятие решения о запрете, одобрении с требованием обязательной маркировки продукта или одобрении без ограничений

Утверждение нового метода оценки безопасности ГМ культур невозможно без доказательства его преимущества.

Примерная схема проведения оценки безопасности ГМ культуры должна включать следующие подробные характеристики:

- ГМ растение и его пищевая ценность,
- источник гена,
- вставленный фрагмент ДНК и смежные с ним участки ДНК,
- экспрессируемые вещества (например, белки),
- потенциальная токсичность и антинутриентные свойства продукта нового гена,
- сравнение продукта введенного гена с белками, вызывающими целиакию, если источником гена является пшеница, ячмень, овёс или рожь,
- потенциальная аллергенность введенного белка,
- количественный анализ основных питательных веществ и антинутриентов в реципиентном растении (включая токсины и аллергены).

На одних этапах оценки требуется анализ имеющейся информации с научных позиций; на других необходимо проведение экспериментов с подробными отчётами, включающими обоснованность и чувствительность методов.


Приложение 2. «Испанцы отличаются от голландцев».

Необходимое условие возникновения аллергии – контакт с аллергеном. Исключением из этого правила является перекрестная реактивность: например, контакт с пыльцой берёзы может вызвать аллергию на яблоки, вишни и фундук. Это явление обычно наблюдается в тех местностях, где много берёз, например, в Голландии. В отсутствии берёзовой пыльцы есть аллергия, например на яблоки в Испании. В недавнем исследовании, направленном на выяснение причин возникновения перекрестной реактивности, сравнивалось около 400 жителей четырёх европейских государств с аллергиями на яблоки. Как и ожидалось, голландцы, австрийцы и жители северной Италии имели аллергические реакции на яблоки из-за того, что у них была аллергия на пыльцу березы. В их сыворотках антитела IgE против основного аллергена берёзовой пыльцы Bet-v 1 перекрестно реагировали с гомологичным основным аллергеном яблока Mal-d1. Аллергия на Mal-d1 проявлялась очень слабо и ограничивалась слизистой оболочкой ротовой полости. Испанцы не контактировали с березовой пыльцой, а обладали сенсибилизацией к непыльцевому аллергену яблок – белку-переносчику жиров Mal-d3. Хотя у большинства исследуемых испанцев аллергия проявлялась слабыми симптомами в ротовой полости, наличие у них IgE против белка-переносчика жиров выделила этих пациентов в группу высокого фактора риска развития тяжелых системных симптомов, что и было обнаружено примерно у 25% испанцев. Это исследование демонстрирует, что на результат оценки аллергенности ГМ культур по анализу сывороток пациентов с похожими клиническими симптомами, вызванными употреблением яблок, сильно влияет место проживания доноров. Подобные случаи фиксировали при аллергии на вишню с доминантным аллергеном Pru-av1 (гомолог березового Bet-v1), по сравнению с белками-переносчиками жиров из вишни, персика и фундука – основными аллергенами в средиземноморских областях. Все эти исследования подчеркивают необходимость изучения подробных историй болезни пациентов и выбора подходящих доноров сывороток для оценки аллергенности ГМ культур, поскольку возможны различия в чувствительности IgE, полученных из сывороток людей разных популяций, к одному продукту.


Приложение 3. Гомология по коротким пептидам: стоит ли овчинка выделки?

Компании Pioneer Hi-Bred International и Dow AgroSciences (Indianapolis, IN, USA) разработали ГМ кукурузу, несущую ген Cry1F из бактерии Bacillus thuringiensis («тюрингская бацилла»). Продукт был одобрен для продажи в США и Канаде, пройдя все этапы регулирующих испытаний, включая оценку потенциальной аллергенности белка Cry1F по нормативам КБП. Белок Cry1F токсичен для личинок мотыльков, таких как кукурузная огнёвка (European corn borer), но не для млекопитающих. Источник гена – неаллергенный организм. Последовательность Cry1F не имеет значительной гомологии ни с одним аллергеном, как показал поиск в базе данных FASTA. Идентичность белка на участке из 80 аминокислот с известными аллергенами составляет менее 35%, по критерию КБП. Регулирующие органы Тайваня потребовали проведения поиска гомологии на 6-ти аминокислотных фрагментах Cry1F с известными аллергенами: обнаружили единственный аллерген Der-p7 из клеща домашней пыли. Хотя белок Cry1F не имел других гомологичных с Der-p7 фрагментов, регулирующие органы Тайваня потребовали проверить Cry1F на перекрестную реактивность с IgE из сывороток пациентов с аллергией на клещей домашней пыли. Результаты тестирования оказались отрицательными: IgE, связывавшиеся с Der-p7, не взаимодействовали с Cry1F. Продукт был одобрен.

Эти эксперименты дорогостоящи и всегда есть вероятность появления слабого связывания IgE, что могло привести к требованию проведения экспериментов in vivo. Эти исследования не показали бы риска развития аллергии у потребителей, поскольку известно, что два IgE-антитела на поверхности тучной клетки должны связаться с антигеном (здесь – с Cry1F) для освобождения клетками медиаторов аллергии.


Приложение 4. Миссия невыполнима: оценка изменений эндогенной «гипоаллергенности»?

Трансгенный рис LLRICE62 (Liberty Link-rice) обладает устойчивостью к гербицидам благодаря бактериальному гену bar, кодирующему фосфинотрицин N-ацетил трансферазу (ФАТ), phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT). Его разработала компания «Авентис Кроп Cайенс», США (Aventis CropScience, теперь - Bayer CropScience, LP, Research Triangle Park, NC, USA). Бактерия Streptomyces hygroscopicus (источник bar) не является аллергенной, а последовательность белка не гомологична в достаточной степени ни одному известному аллергену. Негликозилированная форма белка ФАТ быстро расщепляется пепсином в пищеварительном тракте в стандартных условиях. Согласно нормативам и на основании этих данных не было необходимости в анализе IgE связывания для оценки потенциальной аллергенности белка ФАТ. Регулирующие органы США одобрили продукт в 1999 году. Редкие случаи аллергии на рис подтолкнули компанию-разработчика к решению сравнить эндогенную аллергенность LLRICE62 с нетрансгенным сортом риса по анализу связывания IgE in vitro. Людей с истинной аллергией на рис (провокационные пробы положительны) найти нелегко. Поэтому сыворотки для исследования брали у индивидуумов с пищевой аллергией и имеющих IgE против риса, с положительными ККТ на рисовый экстракт и у тех пациентов, чьи истории болезни предполагали наличие аллергии на рис. Достоверных результатов получить не удалось, поскольку среди выбранных доноров сыворотки было очень мало людей с истинной аллергией на рис.

Другое исследование не выявило значительной разницы между ГМ и генетически подобным традиционным сортом риса по связыванию IgE и содержанию аллергенов. Значимость результатов, полученных на сыворотках людей с недоказанной аллергией на рис, сомнительна. Несмотря на это, канадские регулирующие органы одобрили LLRICE62 в 2006 году после представленной оценки потенциальной аллергенности, включавшей анализ сывороток на связывание IgE. Требование оценки изменений эндогенной аллергенности ГМ культур при экстремально низкой аллергенности получаемой из нее пищи представляется весьма спорным, поскольку результаты исследований оказываются в большинстве случаев бессмысленными.

Однако история этим не заканчивается. В традиционном не трансгенном сорте риса недавно обнаружили семена, похожие на LLRICE601. В ответ на требование регулирующих органов представить информацию о безопасности LLRICE601, компания «Байер КропСайенс» нашла канадский запрос по LLRICE62 и решила провести такое же исследование, если оно осуществимо. Но не осталось сывороток, на которых проводились эксперименты для LLRICE62. По опросу практикующих аллергологов из Австрии, Японии, Кореи, Тайваня и США выяснилось, что практически невозможно найти доноров сыворотки с клинически определенной аллергией на рис (как на пищу) и от исследования пришлось отказаться. Поскольку людям с аллергией на рис следовало бы избегать его употребления и таких индивидуумов вообще очень мало, смысл проведения подобного исследования остается загадочным.


Приложение 5. Сомнительная экспериментальная модель на животных.

Для защиты гороха от жуков-зерноедов в горох перенесли ген, кодирующий ингибитор альфа-амилазы (αАI) из фасоли. Компания-разработчик протестировала продукт на мышах, используя повторную внутрижелудочную сенсибилизацию и провокационный тест внутри трахеи, согласно требованиям нормативов ПСО/ВОЗ. Такую модель до сих пор не использовали для оценки аллергенности пищевых белков. В результате экспериментов обнаружили аккумуляцию эозинофилов в лёгких мышей, сенсибилизированных ГМ горохом (или белком αАI), по сравнению с фасолью. Это означает наличие воспаления, вызванного Th2-лимфоцитами, а не обязательно IgE-опосредованную аллергию. В отчете компании-разработчика отмечались структурные различия N-гликанов у белков αАI из ГМ гороха и традиционной фасоли. У разных бобовых протеолиз C-конца белка происходил по-разному. Авторы работы заключили, что именно различия в расщеплении белка у фасоли и у гороха объясняют повышенную иммуногенность ГМ продукта.

Механизм различной реакции мышей на ГМ горох и фасоль остался не выясненным и примененная мышиная модель редко использовалась для оценки аллергенности белков, а согласно нормативам КБП модель на животных должна быть хорошо проверенной. В случае с ГМ горохом и фасолью разницу в структуре гликанов и белковым процессингом лучше было бы оценить по связыванию с IgE из сывороток людей с аллергией на бобовые, если бы этого потребовали регулирующие органы.

Несмотря на факт отсутствия научных доказательств в пользу повышенного риска IgE-опосредованной пищевой аллергии у людей, это исследование настроило общественность негативно по отношению к ГМ культурам в плане их повышенной аллергенности. Хотя компания-разработчик не опубликовала биоинформационную оценку белка alpha-АI, поиск по гомологии с помощью FASTA на AllergenOnline на 80-ти аминокислотном участке обнаружил с 41% идентичностью агглютинин фундука – предполагаемый аллерген. Перед тем, как одобрить или запретить ГМ alphaАI горох, следовало бы оценить аллергенность агглютинина фундука, а белок alphaАI имело бы смысл проверить на перекрестную реактивность с ним и провести тестирование на IgE-связывание, согласно нормативам КБП. В любом случае, заключение об аллергенности не следовало бы основывать на результатах, полученных на животных.


Приложение 6. Эксперименты на Balb/c мышах не заменяют оценку IgE связывания.

Ген, кодирующий амарантин, перенесли из растения амаранта печального (Amaranthus hypochondriacus) в кукурузу. Белок полностью расщепляется пепсином, а поиск по гомологии идентифицировал несколько 6-, 7- и 8-аминокислотных участков, идентичных известным аллергенам. Несмотря на найденные по гомологии аллергены, разработчик решил оценивать аллергенность ГМ кукурузы по модели на мышах. Сравнение амарантина с последовательностями белков в базе данных FASTA определило несколько аллергенов с 70% идентичностью на 80-аминокислотном сегменте и аллергены 11S глобулины с идентичностью выше 40% при сравнении на всей последовательности белка. Разработчику сразу следовало бы убедиться в опасности белка или хотя бы протестировать его на связывание IgE. Вместо этого иммуногенность продукта проверили на Balb/c мышах. Не обнаружив значительной аллергической реакции, авторы решили, что продукт не аллергенен. Неизвестно, представляли ли этот продукт на суд регулирующих органов, но, согласно требованиям нормативов КБП, ГМ кукурузу, содержащую амарантин, следовало хотя бы проверить на связывание с IgE из сывороток людей с аллергиями на гречиху и на бразильский орех.


По материалам:
Goodman R.E., Vieths S., Sampson H.A., Hill D. et al. Allergenicity assessment of genetically modified crops-what makes sense? Nature Biotechnology 26, 73 - 81 (2008) Published online: 8 January 2008 | doi:10.1038/nbt1343

Перевод: Дарья Червякова,
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология»

Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей