Культивирование вируса клещевого энцефалита в биреакторе

26.01.200451270

Культивирование вируса клещевого энцефалита в биреакторе с газовихревым перемешиванием.


Н.В. Бакулева, В.В. Щурихина, О.И. Шарова, Шквыря Н.С.

ФГУП НПО “Вирион” г. Томск (sajany@ngs.ru, arnika@online.sinor.ru )



В статье приведено описание экспериментов, подтверждающих возможность культивирования вируса КЭ в суспензионной культуре ККЭ в биореакторе Биок с газо-вихревым способом перемешивания. Из вирусной взвеси, репродуцированной в реакторе, была приготовлена экспериментальная серия вакцины, которая соответствовала требованиям нормативно-технической документации на препарат ЭнцеВир (2). В частности: иммуногенность по МИД50 была 0,0029 мл, содержание белков куриного эмбриона - менее 0,66 мкг/мл, содержание вирусного белка - 4,1 мкг/мл. Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность культивирования вируса КЭ (штамм 205) в первичной суспензионной культуре ККЭ в биореакторе с газовихревым перемешиванием.


Ключевые слова: ферментер, биореактор, вакцина, клещевой энцефалит, эмбриональные клетки.


The cultivation of the tick-borne encephalitis virus based on the use of Gas-Vortex Bioreactors.


N.V.Bakuleva, V.V.Schurihina, O.E.Sharova, Shkvirya N.S.

FGUP NPO "Virion", Tomsk, Russia (sajany@ngs.ru, arnika@online.sinor.ru).


Key words: fermenter, bioreactor, vaccine, tick-borne encephalitis, embryonic cells.



The cultivation of the tick-borne encephalitis virus based on the use of Gas-Vortex Bioreactors. The technique of the cultivation of the tick-borne encephalitis virus based on the use of Gas-Vortex Bioreactors is described in this work. The batch of vaccine for the tick-borne encephalitis with 0,0029 ml Immunogenicity, the content of chicken embryonic protein less than 0,66 mkg/ml, the content of virus protein 4,1 mkg/ml has been obtained.




Исходным материалом для получения всех коммерческих вакцин клещевого энцефалита (КЭ) являются первичные культуры клеток куриного эмбриона (ККЭ), которые заражаются посевным вирусом, культивируются для размножения вируса в них и накопления вирусных антигенов в культуральной жидкости. Производственный штамм вируса и способы культивирования различаются у разных производителей вакцин. Важным является создание благоприятных условий жизнедеятельности клеток, оптимальных для размножения вируса и предотвращения лизиса клеток, который может приводить к обогащению среды культивирования и первичного вирусного сбора (полуфабриката вакцины) гетерологичными белками куриного эмбриона.

В технологии производства вакцины «ЭнцеВир» для накопления вируса КЭ используют метод культивирования зараженной взвешенной культуры ККЭ на роллерных установках (2). Он имеет ряд преимуществ, в частности, позволяет получать достаточно высокие урожаи вирусного антигена. В то же время, он не лишен недостатков в плане создания стандартных условий культивирования в отдельных роллерных бутылях по рН, концентрации клеток, воздухообмену. В результате первичный полуфабрикат вакцины может значительно различаться по количественному и качественному содержанию вирусного белка и примесных белков. Поэтому актуальным для нас становится вопрос о возможности перехода к управляемому способу культивирования клеток и репродукции вируса в них, который позволит решить проблему масштабирования производства «вирусной взвеси» и одновременно ее стандартизации.

Целью работы являлась оценка возможности культивирования вируса КЭ в суспензионной культуре ККЭ в биореакторе «Биок» с газовихревым способом перемешивания.


Материалы и методы

Эксперименты проводили на лабораторной модели газовихревого биореактора «Биок» вместимостью10 л (1). В этом реакторе перемешивание осуществляется без застойных зон и, благодаря исключению из объема жидкости областей с высоким уровнем турбулентности, снижается травмируемость клеток, что позволяет проводить суспензионное культивирование клеточных культур чувствительных к механическому воздействию.

Приготовление зараженной клеточной взвеси осуществляли по регламентированной методике (2). Для загрузки в реактор использовали клеточную взвесь с концентрацией от 2,0 млн./мл до 3,4 млн./мл. Объем культивирования - 6,0 л, температурный режим - (36+1)ºС, скорость оборотов активатора от 1100 до 1500 об/мин. РН культуральной среды поддерживали на уровне 7,10- 7,50 подачей воздуха в воздушное пространство реактора со скоростью 6,0-10,0 л/мин и внесением раствора натрия гидроксида при необходимости. Время культивирования – 94-96 ч. В контрольном опыте такую же зараженную клеточную взвесь культивировали в роллерных бутылях по регламентированной технологии в объеме 6,0 л (2). Ежесуточно производили отбор проб экспериментальной и контрольной «вирусной взвеси» для оценки динамики изменения рН, антигенной активности, инфекционной активности стандартными методами (2,3). Содержание вирусного белка Е определяли в твердофазном ИФА с использованием моноклональных антител (МКА) к вирусу КЭ: иммуносорбент – на основе МКА 10Н10, коньюгат – на основе МКА ЕВ1. Для построения калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации вирусного белка в пробе использовали стандартный образец белка Е вируса КЭ с концентрацией 20 мкг/мл. Иммуносорбент, коньюгат и стандарт белка Е приготовлены в НПЦ «Вектор».


Результаты и обсуждение

Клеточная культура, используемая в экспериментах, представляла собой смесь отдельных клеток и агрегатов клеток. Установлено, что репродукция вируса в культуре ККЭ в биореакторе зависела от режима вращения жидкости в нем (табл.1). При перемешивании со скоростью вращения двигателя 1300-1500 об/мин создавались условия для накопления вирусного белка и его антигенной активности в количествах, сопоставимых с регламентированной технологией. При уменьшении скорости вращения до 1100-1200 об/мин, содержание белка Е в культуральной жидкости, полученной в реакторе, снижалось в 1,2-2,5 раза, а по сравнению с контрольным опытом более чем в 2 раза. Увеличение концентрации клеток в реакторе не приводило к увеличению концентрации вирусного белка в культуральной жидкости и возрастанию его антигенной активности. Можно также отметить, что при культивировании в реакторе концентрация белка Е и антигенная активность вируса отличаются меньшей вариабельностью, что можно объяснить более стандартными условиями репродукции вируса КЭ, по сравнению с условиями в контрольных бутылях.

Анализ «вирусной взвеси», произведенной в реакторе, на содержание белков куриного эмбриона показал небольшое обогащение вируссодержащей жидкости гетерологичным белком. Содержание куриного белка было 3,5-6,0мкг/мл, что сопоставимо с его количеством при культивировании клеток в бутылях.


Таблица 1

Инфекционная, антигенная активность и концентрация белка Е вируса КЭ штамма «205» в «вирусной взвеси», полученной в реакторе и в роллерных бутылях.



































































































































































№ экс пери мен та

Посевная доза клеток

(млн./мл)


Скорость вращения двигателя (об/мин)


Инфекционная активность*

(lg ЛД50/0,03мл)


Антигенная активность*

(1/ титр)


Концентрация белка Е*

(мкг/мл)


Реактор


Контроль


Реактор


Контроль


Реактор


Контроль


Реактор


Контроль


1


2,2


2,2


1300


10,7


10,7


128


128


н.и.


н.и.


2


2,5


2,5


1300


7,7


10,5


65


128


4,1


3,5


3


2,5


2,5


1300


10,1


9,2


128


64


3,4


3,3


4


2,7


2,7


1300


7,8


11,5


128


128


3,8


3,8


5


2,3


2,3


1200


н.и.


н.и.


128


128


2,0


4,9


6


2,3


2,3


1200


11,5


7,5


64


32


2,4


0,5


7


2,3


2,3


1100


7,5


10,1


64


128


2,1


8,9


8


2,2


2,2


1100


11,5


11,5


128


32


1,5


4,2


9


3,0


2,3


1400


н.и.


7,5


64


128


3,2


3,1


10


3,4


2,5


1400


11,0


7,5


128


128


2,9


3,5


11


3,4


2,4


1500


1,5


11,5


128


128


3,1


3,4


12


3,3


2,8


1500


11,5


11,5


128


н.и.


2,6


н.и.


13


3,0


2,4


1500


7,5


8,3


128


128


3,0


2,4


* Примечание: в таблице указаны результаты, полученные на 4-е сутки репродукции вируса, в период максимального его накопления в культуральной жидкости.


Из вирусной взвеси, репродуцированной в реакторе, была приготовлена экспериментальная серия вакцины, которая соответствовала требованиям нормативно-технической документации на препарат «ЭнцеВир» (2). В частности: иммуногенность по МИД50 была 0,0029 мл, содержание белков куриного эмбриона - менее 0,66 мкг/мл, содержание вирусного белка - 4,1 мкг/мл.

Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность культивирования вируса КЭ (штамм «205») в первичной суспензионной культуре ККЭ в биореакторе с газовихревым перемешиванием.


Литература:




  1. Н.П. Мертвецов, Ю.А. Рамазанов, А.П. Репков, А.Н. Дударев, В.И. Кислых. Газовихревые биореакторы “Биок”, Новосибирск, 2002 г.


  2. Вакцина клещевого энцефалита очищенная концентрированная инактивированная сорбированная жидкая (ЭнцеВир). Регламент производства № 1147–01.


  3. Вакцина клещевого энцефалита очищенная концентрированная инактивированная сорбированная жидкая (ЭнцеВир). ФСП 42-0135-1790-01.


 


Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей