Культивирование вируса клещевого энцефалита в биреакторе

Культивирование вируса клещевого энцефалита в биреакторе с газовихревым перемешиванием.

Н.В. Бакулева, В.В. Щурихина, О.И. Шарова, Шквыря Н.С.

ФГУП НПО “Вирион” г. Томск (sajany@ngs.ru, arnika@online.sinor.ru )

В статье приведено описание экспериментов, подтверждающих возможность культивирования вируса КЭ в суспензионной культуре ККЭ в биореакторе Биок с газо-вихревым способом перемешивания. Из вирусной взвеси, репродуцированной в реакторе, была приготовлена экспериментальная серия вакцины, которая соответствовала требованиям нормативно-технической документации на препарат ЭнцеВир (2). В частности: иммуногенность по МИД50 была 0,0029 мл, содержание белков куриного эмбриона - менее 0,66 мкг/мл, содержание вирусного белка - 4,1 мкг/мл. Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность культивирования вируса КЭ (штамм 205) в первичной суспензионной культуре ККЭ в биореакторе с газовихревым перемешиванием.

Ключевые слова: ферментер, биореактор, вакцина, клещевой энцефалит, эмбриональные клетки.

The cultivation of the tick-borne encephalitis virus based on the use of Gas-Vortex Bioreactors.

N.V.Bakuleva, V.V.Schurihina, O.E.Sharova, Shkvirya N.S.

FGUP NPO "Virion", Tomsk, Russia (sajany@ngs.ru, arnika@online.sinor.ru).

Key words: fermenter, bioreactor, vaccine, tick-borne encephalitis, embryonic cells.

The cultivation of the tick-borne encephalitis virus based on the use of Gas-Vortex Bioreactors. The technique of the cultivation of the tick-borne encephalitis virus based on the use of Gas-Vortex Bioreactors is described in this work. The batch of vaccine for the tick-borne encephalitis with 0,0029 ml Immunogenicity, the content of chicken embryonic protein less than 0,66 mkg/ml, the content of virus protein 4,1 mkg/ml has been obtained.

Исходным материалом для получения всех коммерческих вакцин клещевого энцефалита (КЭ) являются первичные культуры клеток куриного эмбриона (ККЭ), которые заражаются посевным вирусом, культивируются для размножения вируса в них и накопления вирусных антигенов в культуральной жидкости. Производственный штамм вируса и способы культивирования различаются у разных производителей вакцин. Важным является создание благоприятных условий жизнедеятельности клеток, оптимальных для размножения вируса и предотвращения лизиса клеток, который может приводить к обогащению среды культивирования и первичного вирусного сбора (полуфабриката вакцины) гетерологичными белками куриного эмбриона.

В технологии производства вакцины «ЭнцеВир» для накопления вируса КЭ используют метод культивирования зараженной взвешенной культуры ККЭ на роллерных установках (2). Он имеет ряд преимуществ, в частности, позволяет получать достаточно высокие урожаи вирусного антигена. В то же время, он не лишен недостатков в плане создания стандартных условий культивирования в отдельных роллерных бутылях по рН, концентрации клеток, воздухообмену. В результате первичный полуфабрикат вакцины может значительно различаться по количественному и качественному содержанию вирусного белка и примесных белков. Поэтому актуальным для нас становится вопрос о возможности перехода к управляемому способу культивирования клеток и репродукции вируса в них, который позволит решить проблему масштабирования производства «вирусной взвеси» и одновременно ее стандартизации.

Целью работы являлась оценка возможности культивирования вируса КЭ в суспензионной культуре ККЭ в биореакторе «Биок» с газовихревым способом перемешивания.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на лабораторной модели газовихревого биореактора «Биок» вместимостью10 л (1). В этом реакторе перемешивание осуществляется без застойных зон и, благодаря исключению из объема жидкости областей с высоким уровнем турбулентности, снижается травмируемость клеток, что позволяет проводить суспензионное культивирование клеточных культур чувствительных к механическому воздействию.

Приготовление зараженной клеточной взвеси осуществляли по регламентированной методике (2). Для загрузки в реактор использовали клеточную взвесь с концентрацией от 2,0 млн./мл до 3,4 млн./мл. Объем культивирования - 6,0 л, температурный режим - (36+1)ºС, скорость оборотов активатора от 1100 до 1500 об/мин. РН культуральной среды поддерживали на уровне 7,10- 7,50 подачей воздуха в воздушное пространство реактора со скоростью 6,0-10,0 л/мин и внесением раствора натрия гидроксида при необходимости. Время культивирования – 94-96 ч. В контрольном опыте такую же зараженную клеточную взвесь культивировали в роллерных бутылях по регламентированной технологии в объеме 6,0 л (2). Ежесуточно производили отбор проб экспериментальной и контрольной «вирусной взвеси» для оценки динамики изменения рН, антигенной активности, инфекционной активности стандартными методами (2,3). Содержание вирусного белка Е определяли в твердофазном ИФА с использованием моноклональных антител (МКА) к вирусу КЭ: иммуносорбент – на основе МКА 10Н10, коньюгат – на основе МКА ЕВ1. Для построения калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации вирусного белка в пробе использовали стандартный образец белка Е вируса КЭ с концентрацией 20 мкг/мл. Иммуносорбент, коньюгат и стандарт белка Е приготовлены в НПЦ «Вектор».

Результаты и обсуждение

Клеточная культура, используемая в экспериментах, представляла собой смесь отдельных клеток и агрегатов клеток. Установлено, что репродукция вируса в культуре ККЭ в биореакторе зависела от режима вращения жидкости в нем (табл.1). При перемешивании со скоростью вращения двигателя 1300-1500 об/мин создавались условия для накопления вирусного белка и его антигенной активности в количествах, сопоставимых с регламентированной технологией. При уменьшении скорости вращения до 1100-1200 об/мин, содержание белка Е в культуральной жидкости, полученной в реакторе, снижалось в 1,2-2,5 раза, а по сравнению с контрольным опытом более чем в 2 раза. Увеличение концентрации клеток в реакторе не приводило к увеличению концентрации вирусного белка в культуральной жидкости и возрастанию его антигенной активности. Можно также отметить, что при культивировании в реакторе концентрация белка Е и антигенная активность вируса отличаются меньшей вариабельностью, что можно объяснить более стандартными условиями репродукции вируса КЭ, по сравнению с условиями в контрольных бутылях.

Анализ «вирусной взвеси», произведенной в реакторе, на содержание белков куриного эмбриона показал небольшое обогащение вируссодержащей жидкости гетерологичным белком. Содержание куриного белка было 3,5-6,0мкг/мл, что сопоставимо с его количеством при культивировании клеток в бутылях.

Таблица 1

Инфекционная, антигенная активность и концентрация белка Е вируса КЭ штамма «205» в «вирусной взвеси», полученной в реакторе и в роллерных бутылях.

* Примечание: в таблице указаны результаты, полученные на 4-е сутки репродукции вируса, в период максимального его накопления в культуральной жидкости.

Из вирусной взвеси, репродуцированной в реакторе, была приготовлена экспериментальная серия вакцины, которая соответствовала требованиям нормативно-технической документации на препарат «ЭнцеВир» (2). В частности: иммуногенность по МИД50 была 0,0029 мл, содержание белков куриного эмбриона - менее 0,66 мкг/мл, содержание вирусного белка - 4,1 мкг/мл.

Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность культивирования вируса КЭ (штамм «205») в первичной суспензионной культуре ККЭ в биореакторе с газовихревым перемешиванием.

Литература:

1. 
   
   Н.П. Мертвецов, Ю.А. Рамазанов, А.П. Репков, А.Н. Дударев, В.И. Кислых. Газовихревые биореакторы “Биок”, Новосибирск, 2002 г.


2. 
   
   Вакцина клещевого энцефалита очищенная концентрированная инактивированная сорбированная жидкая (ЭнцеВир). Регламент производства № 1147–01.


3. 
   
   Вакцина клещевого энцефалита очищенная концентрированная инактивированная сорбированная жидкая (ЭнцеВир). ФСП 42-0135-1790-01.