Система CRISPR-Cas9 впервые использована для мечения РНК в живых клетках

21.03.20168000

Долгое время ученые находились в поиске эффективного метода мечения РНК – молекулы-посредника между последовательностью ДНК и соответствующим белком – в живых клетках. Исследователям из Медицинской Школы Калифорнийского Университета Сан-Диего (University of California, San Diego School of Medicine, США) преуспели в этом, применив популярную методику редактирования ДНК CRISPR-Cas9 к РНК. Результаты исследования опубликованы в журнале Cell).

Генетический код ДНК определяет в нашем организме все, от цвета глаз до предрасположенности к заболеваниям. Это мотивировало ученых секвенировать геном человека и разрабатывать способы внесения модификаций в последовательность ДНК. Однако многие заболевания связаны с другой фундаментальной молекулой – РНК. Исследователи долгое время искали эффективный метод мечения в живых клетках РНК, являющейся посредником, переносящим генетическую информацию из клеточного ядра.

«Эта работа является первым известным нам примером мечения РНК в живых клетках с помощью системы CRISPR-Cas9, – говорит старший автор исследования Джин Йео (Gene Yeo), доктор философии, доцент клеточной и молекулярной медицины, – Наша настоящая работа сосредоточена на слежении за передвижением РНК внутри клетки. Однако дальнейшее развитие темы может помочь исследователям оценивать другие свойства РНК или разработать дополнительные терапевтические подходы для коррекции заболеваний, связанных с РНК».

Расположение РНК в клетке и то, как и когда она туда попадает, может влиять на синтез белка в необходимом месте и в нужное время. Например, белки, критичные для нейронных связей мозга (синапсов) синтезируются на основе РНК, локализованной в этих контактах. Нарушение транспорта РНК связано с рядом заболеваний от аутизма до рака, потому исследователям необходимы способы слежения за передвижением РНК для разработки методов лечения этих состояний.

Попытки редактирования последовательности ДНК с целью лечения заболеваний увенчались значительным успехом за последние несколько лет. Именно тогда исследователи установили, что они могут использовать технологию CRISPR-Cas9, являющуюся естественным защитным механизмом бактерий, и применять ее для редактирования генов в клетках млекопитающих.

В норме CRISPR-Cas9 работает следующим образом: исследователи создают молекулу РНК-гид, совпадающую с последовательностью нужного гена-мишени. РНК-гид направляет фермент Cas9 в желаемый участок генома, где фермент режет ДНК. Клетка восстанавливает последовательность ДНК неточно, таким образом инактивируя ген, либо исследователи замещают соседний с надрезом фрагмент нужной версией гена.

До настоящего времени система CRISPR-Cas9 могла использоваться только для работы с ДНК. Йео с коллегами из Калифорнийского Университета в Беркли (University of California, Berkeley, США) применил метод для разработки удобного средства мечения РНК в живых клетках, названного РНК-меченая Cas9 (RCas9).

Чтобы воздействовать на РНК вместо ДНК, исследователи изменили некоторые особенности системы CRISPR-Cas9. Основываясь на предыдущей работе соавтора Дженнифер Доудна (Jennifer Doudna), доктора философии из Университета Беркли, они создали короткую нуклеиновую кислоту PAMmer, которая совместно с РНК-гидом направляет Cas9 к молекуле РНК.

Для оценки работы системы группа Йео пометила РНК, кодирующую белки ACTB, TFRC и CCNA2. Исследователи проследили как Cas9, связанная с флуоресцентным белком, детектировала передвижение РНК к стрессовым гранулам – кластеру белков и РНК, формируемых в цитозоле клетки (пространстве за пределами ядра), когда клетка подвергается стрессу. Стрессовые гранулы связаны с такими нейродегенеративными нарушениями, как боковой амиотрофический склероз (БАС). Эта система позволила ученым отслеживать РНК в живых клетках в течение некоторого времени без необходимости вводить искусственные метки, обычно используемые в других методах мечения РНК и, возможно, искажающие нормальные клеточные процессы.

«CRISPR-Cas9 обусловливает революцию в геномике и медицине в связи в возможностью модифицировать ДНК человека, – говорит Дэвид Неллес (David Nelles), выпускник Школы Инженерии Джейкобса (UC San Diego Jacobs School of Engineering) при UCSD, студент лаборатории Йео и первый автор исследования, – ДНК является фундаментальным строительным блоком жизни и мы только начинаем видеть смысл генной инженерии благодаря системе CRISPR-Cas9, однако многие заболевания, включая рак и аутизм, связаны с проблемами другой фундаментальной биологической молекулы – РНК».

Клетка, несущая систему RCas9, способную детектировать распределение мРНК бета-актина в цитоплазме. (фото: UC San Diego Health)

По материалам University of California - San Diego

Оригинальная статья:
David A. Nelles, Mark Y. Fang, Mitchell R. O’Connell, Jia L. Xu, Sebastian J. Markmiller, Jennifer A. Doudna, Gene W. Yeo. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell, 2016; DOI: 10.1016/j.cell.2016.02.054


Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей