Молекулярные маяки помогут «осветить» процесс трансформации стволовых клеток

Хорошо знакомая многим молекулярным биологам, занимающимся ПЦР, методика молекулярных маяков теперь может помочь и клеточным биологам. Ученые из Университета Брауна (Brown University) в Род Айленде (США) сконструировали молекулярные маяки, которые позволяют проводить мониторинг экспрессии гена в живых популяциях стволовых клеток в процессе их превращения в определенную ткань в режиме реального времени. Технология может стать для специалистов по тканевой инженерии мощным инструментом для исследования трансформации стволовых клеток – ключевого процесса, лежащего в основе разработок в области регенеративной медицины.

Молекулярные маяки представляют собой короткие олигонуклеотиды, несущие в себе флуорохром и гаситель флуоресценции. В состоянии покоя флуоресценция ингибируется за счет наличия гасителя, однако при присоединении молекулярного маяка к мишени (комплементарной последовательности ДНК либо РНК), флуорохром разгорается, что позволяет проводить количественную (или качественную – в зависимости от типа анализа) оценку мишеней в исследуемом образце в режиме реального времени.

Исследования проводились на полученных их жировой ткани стволовых клетках, трансформируемых в клетки костной ткани. Ученые – Эрик Дарлинг, доцент биологии Кафедры Молекулярной Фармакологии, Физиологии и Биотехнологии (the Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology) и Хетал Дезаи (Hetal Desai), студент из Университета Брауна – создали маяки, комплементарно связывающиеся с тремя РНК-транскриптами специфических генов стволовых клеток, экспрессирующихся в процессе трансформации стволовых клеток в клетки костной ткани. Связываясь с транскриптами, маяки продуцировали флуоресцентный сигнал, по уровню которого можно было оценить экспрессию каждого из трех анализируемых генов в ходе клеточной трансформации.

«Мы не изобретатели молекулярных маяков, мы лишь задействовали эту методику способом, ранее никем ранее не применявшимся для подобных целей. Он заключается в длительном культивировании и наблюдении популяционных изменений достоверным и испытанным способом», - рассказывает Дезаи, главный автор статьи, опубликованной в журнале Tissue Engineering Part A.

«В течение 21 дня развития в ходе эксперимента клетки оставались живыми,- рассказывает Дезаи, - При этом некоторые клеточные популяции подвергались химической стимуляции для дифференцировки в костную ткань, другие – нет. В течение трех недель команда исследователей наблюдала популяции на предмет флуоресценции маяков, чтобы определить количество стволовых клеток в каждой популяции, дифференцирующихся в клетки костной ткани, а также сроки экспрессии каждого гена».

Флуоресценция маяков позволяет наблюдать отдельные паттерны в определенные сроки. Максимума экспрессии в более чем 90% индуцированных клеток, подвергшихся стимуляции, первой (на 4-й день) достигла экспрессия гена щелочной фосфатазы ALPL. Затем, на 14-й день, примерно в 85% клеток наблюдался пик экспрессии гена коллагена COL1A1. В последние несколько дней эксперимента наблюдалось отчетливое увеличение экспрессии гена BGLAP в более чем 80% стволовых клеток.

Как отметили исследователи, каждый последующий эпизод экспрессии гена возрастал от нуля до максимума все быстрее, что позволило предположить, что темп клеточной дифференциации с течением времени может стать в популяции более синхронизированным.

«Если найти способ направить клетки на этот путь раньше, то дифференцировка может произойти быстрее», - рассказывает Дарлинг.

В популяциях стволовых клеток, не подвергшихся индуцированию в сторону развития костной ткани, флуоресценции молекулярных маяков не наблюдалось, что указывает на отсутствие экспрессии генов, а, значит, маяки действительно являются индикаторами трансформации из стволовых клеток в клетки костной ткани.

По словам Дезаи, исследователи уделили большое внимание дизайну маяков, чтобы те не повлияли на развитие клеток или их функционирование никаким способом. Несмотря на то, что маяки связываются с матричной РНК, синтезируемой во время экспрессии гена, они не требуют внедрения каких-либо генов в ДНК стволовых клеток, или экспрессии специальных белков, как это бывает во многих других методах наблюдения флуоресценции.

«В тканевой инженерии маяки могут помочь выявлению наиболее эффективных условий дифференцировки большинства стволовых клеток в желаемую ткань, - рассказывает Дарлинг, - Они могли бы помочь специалистам в тканевой инженерии определить наилучшее время для добавления индуцирующих веществ. Кроме того, они могут обеспечить путь для выявления и выращивания только тех клеток, которые дифференцируются в желаемую ткань».

По словам Дарлинга, если в процессе превращения стволовых клеток в клетки костной ткани обогащать среду и избавляться от недифференцирующихся клеток, получится продукт лучшего качества.

«Причина, по которой мы опробовали этот метод, заключается в том, что нам нужна была технология, которую мы могли бы применять на любых клетках, чтобы следить за любым геном и не влиять на саму клетку в процессе наблюдения, - говорит Дарлинг, - Если это действительно работает так, как мы полагаем, то мы действительно сможем наблюдать за любым желаемым геном в режиме реального времени».

Исследование профинансировано Национальными Институтами Здоровья (NIH)

По материалам Brown University

Оригинальная статья:
Hetal V. Desai, Indu S. Voruganti, Chathuraka Jayasuriya, Qian Chen, Eric M. Darling. Live-Cell, Temporal Gene Expression Analysis of Osteogenic Differentiation in Adipose-Derived Stem Cells. Tissue Engineering Part A, 2012; 120905121132000 DOI: 10.1089/ten.tea.2012.0127