Пока еще очень простой молекулярный биокомпьютер способен, тем не менее, оперировать пятью логическими переменными булевой логики. Состояние молекулярного входа кодируется наличием или отсутствием посредников – малых интерферирующих РНК (siRNA). «Механизм» биокомпьютера представляет собой генную сеть, дающую на выходе однозначный ответ – наличие флуоресцентного белка (ИСТИНА) или его отсутствие (ЛОЖЬ).

По определению Н. Винера, «компьютер представляет собой поток входящих сообщений и действие выходящих сообщений, где входящие сообщения обрабатываются набором элементов-посредников».

Действие компьютера основано на принципах булевой логики. Логическая переменная может принимать одно из двух значений: ИСТИНА (TRUE) или ЛОЖЬ (FALSE). Основные действия с булевыми переменными – это операции конъюнкции – И (AND), дизъюнкции – ИЛИ (OR) и логического отрицания – НЕ (NOT). Например, если переменная a имеет значение ИСТИНА, а переменная b – ЛОЖЬ, то результатом операции a И b будет ЛОЖЬ (рис.1a). Любое булево выражение можно представить в двух формах: дизъюнктивной нормальной форме (disjunction normal form – DNF), основанной на операции ИЛИ, или в конъюнктивной нормальной форме (conjunction normal form – CNF), основанной на операции И (рис. 1b,c). Только в одной форме оно будет длиннее, чем в другой.

DNF – это операция ИЛИ, применяемая к выражениям (операторам), состоящим только из операций И и их отрицаний (НЕ, literals) с булевыми переменными (рис. 1b).

CNF – это операция И над операторами, содержащими только дизъюнкцию (ИЛИ) и литералы (НЕ) (рис. 1с). Например, если a = ИСТИНА, b = ЛОЖЬ, c = ИСТИНА, d = ЛОЖЬ, то результатом DNF (a И b И c) ИЛИ (НЕ (a) И d) будет ЛОЖЬ (рис. 1d), т.к. (a И b И c) дает ЛОЖЬ, (НЕ (a) И d) дает тоже ЛОЖЬ, и ЛОЖЬ ИЛИ ЛОЖЬ дает ЛОЖЬ (рис. 1a).

Операторы (clauses) – это логические выражения, составляющие DNF или CNF.

[lib]biocomputer1.gif[/lib]

Рис. 1. Основные действия булевой логики молекулярного компьютера
a – таблицы истинности для операций И (конъюнкции), ИЛИ (дизъюнкции) и НЕ (отрицания).
b, c – пример двух эквивалентных выражений в дизъюнктивной (DNF) и конъюнктивной (CNF) нормальной формах.
d – пример решения булева выражения в b в данном наборе значений истинности.

Как же можно использовать эти законы логики в создании биокомпьютера в клетке человека? Можно организовать генную сеть, которая, в зависимости от кодируемого этой схемой логического выражения, в ответ на наличие или отсутствие на входе – в клеточной среде – сигналов (к примеру, молекул) синтезировала бы в качестве выходного сигнала какой-нибудь легко определяемый белок, например, флуоресцентный.

[lib]biocomputer2.jpg[/lib]Эту идею реализовали ученые из Гарвардского и Принстонского Университетов Рон Вайсс (Ron Weiss) и Яков Бененсон (Yaakov Benenson) с коллегами. Авторы продемонстрировали работу такого биокомпьютера, оперирующего с пятью логическими переменными, в культуре клеток человека. В качестве «автомата», способного включать и выключать гены, они взяли механизм РНК-интерференции (RNA interference, RNAi). Напомним, что за открытие этого механизма Эндрю Файер (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) получили Нобелевскую премию 2006 г. в области физиологии и медицины.

Как известно, на пути от гена к белку находится молекула матричной РНК (мРНК), по которой и ведется синтез белка (трансляция). Механизмом, способным отменить трансляцию, является РНК-интерференция (рис.2). Механизм запускается, когда в клетке появляются короткие интерферирующие РНК (siRNA, от short interfering) – двунитевые молекулы РНК из 21 пары нуклеотидов. Оказавшись в клетке, одна из нитей siRNA связывается с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex). Этот комплекс находит мРНК, которая содержит определенную последовательность – мишень siRNA, и разрезает ее в определенном месте (сайте), последовательность нуклеотидов в котором комплементарна нити siRNA. Результатом этого является уменьшение или, при достаточном количестве siRNA, полное прекращение синтеза соответствующего белка.

Поэтому, если в последовательности нуклеотидов, кодирующие один и тот же флуоресцентный белок, вставить сайты-мишени для siRNA, мы сможем получать этот флуоресцентный белок или его отсутствие в зависимости от того, не связалась или связалась siRNA со своей мишенью на мРНК этого белка. А активность siRNA регулируется состоянием логического молекулярного «входа»: наличием или отсутствием блокирующей или активирующей siRNA молекулы. Вот вам и биокомпьютер!

Генная сеть, иллюстрирующая логическую DNF-форму, включает две или более молекулы мРНК, кодирующие один и тот же белок, но имеющие разные некодирующие последовательности (рис.3). Этот белок и является выходом системы (systems’s output). Если хотя бы одна мРНК транслирована, то результатом молекулярной схемы, описывающей логическую операцию ИЛИ, будет значение ИСТИНА (рис.3a). В схеме, соответствующей логической операции И, в 3’-нетранслируемые концы мРНК, кодирующей «выходной» белок, вставили последовательно мишени для siRNA-A и siRNA-B (рис.3b).

(3'-нетранслируемая область мРНК – последовательность, расположенная после сигнала остановки синтеза белка. Этот участок не кодирует аминокислот, но определяет, в частности, будет ли с данной мРНК производиться белок или она будет уничтожена при определенных условиях.)

В этой ситуации предполагается, что входные молекулы A и B блокируют соответствующие siRNA. Поэтому, чтобы генерировать выход с мРНК, обе молекулы A и B должны присутствовать одновременно (рис.3b).

Если же молекула A будет активировать siRNA, присутствие или отсутствие этого молекулярного входа будет блокировать или запускать трансляцию – синтез белка на соответствующей мРНК. Это соответствует логическому отрицанию – операции НЕ (А). (рис. 3c).

Пример генной DNF-сети показан на рис.3d.

Молекулярный оператор 1 – мРНК флуоресцентного белка ZsYellow с мишенями для siRNA-A, siRNA-C и siRNA-E в UTR участках (мРНК1).

Молекулярный оператор 2 – мРНК того же белка, только UTR область содержит мишени для siRNA-НЕ(А) и siRNA-B (мРНК2).

Если, к примеру, A, C и E присутствуют, то соответствующие siRNA будут блокированы и трансляция светящегося белка будет идти с мРНК1. Хотя siRNA-НЕ(A) будет активной и подавит трансляцию белка ZsYellow с мРНК2, общий результат операции (мРНК1) ИЛИ (мРНК2) будет оценен как ИСТИНА.

[lib]biocomputer3.jpg[/lib]

Рис. 3. Дизайн генной сети молекулярного компьютера на основе DNF-формы
a –схема, иллюстрирующая операцию ИЛИ между молекулами мРНК. В таблице истинности стрелки вверх указывают на присутствие мРНК.
b –схема, описывающая операцию И между молекулярными входами А и B. Фигурки из точек – молекулы или события A и B, блокирующие siRNA при взаимодействии с ними. В таблице истинности стрелки вверх обозначают наличие веществ A и B и белка ZsYellow на выходе как результата конъюнкции.
c – схема, соответствующая логическому отрицанию (операция НЕ) молекулярного входа А, и таблица истинности. Здесь фигурка из точек обозначает активацию siRNA событием (наличием вещества) А.
d – схема генной DNF-сети. Молекулярные входы – точечные линии и фигурки (A, B, C, E). CMV – последовательность для старта производства белка.

Генная сеть, иллюстрирующая логическую CNF-форму, основана на молекулах мРНК, кодирующих белки-репрессоры LacI и LacI-KRAB (рис.4). Репрессоры – это белки, которые, связываясь со своей мишенью на ДНК в промоторно-операторной области (месте старта синтеза мРНК), препятствуют образованию мРНК. Репрессор LacI выделен из бактерии E.сoli, a KRAB – из клеток человека. Связывание LacI (или LacI-KRAB) репрессора с операторной областью LacO, расположенной перед геном, кодирующим выходной белок (здесь – dsRed), препятствует образованию его мРНК и, следовательно, самого белка (в данном случае флуоресцирующего красным белка dsRed). Если репрессор с одной мРНК эффективно блокирует белок dsRed , то для получения последнего на выходе необходимо, чтобы все мРНК, производящие репрессор, были удалены, что соответствует логической операции И (рис.4a).

Как и в схеме с DNF, последовательности-мишени для siRNA вставили в 3’-UTR участки мРНК, кодирующих репрессоры. Но, в противоположность предыдущей схеме, здесь предполагается, что молекулы на входе активируют siRNA, а не блокируют их. Хотя бы одна из двух siRNA, нацеленных на одну мРНК, должна быть активирована, чтобы уничтожить эту репрессорную мРНК (рис.4b). Это приведет к освобождению LacO области от LacI и, соответственно, инициирует образование белка dsRed. Эта ситуация иллюстрирует логическую операцию ИЛИ (рис.4b). В случае с логическим отрицанием (рис.4c) предполагается, что молекулярный вход А блокирует siRNA. В этом случае, если А нет на входе (ЛОЖЬ – FALSE), тогда нет репрессора и есть белок dsRed, что соответствует операции НЕ (А), и на выходе мы имеем ИСТИНУ – TRUE. Пример генной CNF-сети показан на рис.4d. Если молекулярные входы B и С присутствуют, тогда активируются siRNA-B и siRNA-C, снижая количества репрессора LacI, синтезируемого с молекул-операторов мРНК1 и мРНК2. При этом общий уровень белка LacI будет низким, что приведет к освобождению области LacO от LacI. Теперь участок старта синтеза белка dsRed открыт и на выходе имеем большие количества белка dsRed, что соответствует результату ИСТИНА.

[lib]biocomputer4.jpg[/lib]

Рис. 4. Дизайн генной сети молекулярного компьютера на основе СNF-формы
a – схема, иллюстрирующая операцию И между двумя молекулами мРНК. Стрелка вниз в таблице истинности указывает на отсутствие мРНК. CAG – последовательность, кодирующая сигнал старта для синтеза продукта. LacO – мишень для репрессоров LacI и LacI-KRAB.
b – схема, описывающая операцию ИЛИ между молекулярными входами А и B.
c – схема, соответствующая логическому отрицанию (операции НЕ) молекулярного входа А.
d – схема генной CNF-сети. Молекулярные входы – точечные линии и фигурки (A, B, C, E). CMV и CAG – промоторы (последовательности старта производства белка).

Экспериментально эти генные схемы были реализованы в культурах клеток человеческих эмбриональных почек (293-Н). В эти клетки одновременно вводили гены, соответствующие используемой логической форме – DNF (рис.3d) или CNF (рис.3b,d), и имитировали действие входных сигналов добавлением или отсутствием соответствующих молекул siRNA. Выходные сигналы в виде количества соответствующих белков анализировали через 48 часов. Молекулы siRNA и их мишени сконструировали на основе известных последовательностей – T1 и T2 из морского кораллового полипа Renilla reniformis, FF3 и FF4 – из люцифераз светлячков и S14 из eGFP – зеленого флуоресцентного белка медузы.

Для двух генных сетей, соответствующих двум DNF-формам, были просчитаны все варианты пяти входных переменных (табл.1а).

Форме D1 – (A И B И C ) ИЛИ (D И E) – соответствуют два молекулярных оператора. Один из них содержит в нетранслируемом конце гена ZsYellow последовательные мишени для siRNA, блокирующих синтез белков T1 (A), T2 (B) и S14 (C). В тот же участок второго гена-оператора встроены мишени для siRNA FF3 (D) и FF4 (E) (в соответствии с рис. 3d).

Форме D2 – (A И C И E) ИЛИ (НЕ(A) И B) – соответствуют молекулярный оператор 1, содержащий в нетранслируемом конце гена ZsYellow последовательные мишени для siRNA, блокирующих синтез белков FF4 (A), T1 (C) и S14 (E), и молекулярный оператор 2, содержащий мишени для siRNA, блокирующих синтез FF3 (НЕ(A)) и T2 (B) в том же участке (в соответствии с рис.3d).

Интенсивности флюоресценции (цифры справа от фотографий) соответствуют количеству синтезируемых выходных белков и показывают явное различие между группами «ЛОЖЬ» и «ИСТИНА» (в среднем в 16 раз), как и требуется в логическом выражении. В случае со всеми значениями переменных «ИСТИНА» в D1 (когда нет ни одной siRNA) количество выходного белка более чем вдвое превышало остальные положительные результаты, что отражало параллельный выход белков с обеих операторных мРНК.

Работу генных схем CNF оценивали по комбинациям двух переменных. Авторы использовали две CNF-формы.

Форма С1 соответствовала операции ИЛИ внутри оператора (рис.4b), форма С2 иллюстрирует действие И между операторами (рис.4d). Для оценки работы CNF-форм мишени молекул siRNA вставили в 3’-нетранслируемые участки гена, кодирующего репрессор LacI.

В форме C1 (D ИЛИ E) использовали молекулу-оператор CMV-LacI-FF3-FF4, содержащую мишени для siRNA FF3(D) и FF4(E), и регулируемый этой конструкцией белок dsRed в т.н. репортерной молекуле CAGOP-dsRed. Значения «ИСТИНА» отличаются от результатов «ЛОЖЬ» в форме C1 более чем в 3 раза. По сравнению с генной схемой DNF CNF-форма С1 работает не так эффективно (там количество репортерного белка различается в 16 раз). Поэтому авторы попытались увеличить разницу между «ИСТИНОЙ» и «ЛОЖЬЮ», действуя «на два фронта».

Чтобы сильнее подавить выработку репортерного белка dsRed, они взяли более сильный репрессор – LacI-KRAB, а в молекулу-оператор вставили вместо одной три последовательных мишени для siRNA FF3 и FF4: CMV-LacI-KRAB-FF3*3-FF4*3. Ожидалось, что утроение числа мишеней для репрессорных siRNA и усиленное подавление синтеза репортерного белка более активным репрессором заметно увеличат разницу между результатами, но это привело лишь к двукратному улучшению (разница в 6 раз).

В форме C2 авторы смоделировали операцию И – (D) И (E) (рис.4d): молекула-оператор CMV-LacI-FF3*3 с тремя мишенями для siRNA FF3 (D), молекула-оператор CMV-LacI-FF4*3 с тремя мишенями для siRNA FF4 (E) и репортерная молекула CAGOP-dsRed.

С2 принимает значение ИСТИНА только тогда, когда синтез репрессоров на обеих мРНК подавлен, т.е. когда присутствуют обе siRNA (FF3 и FF4) (рис. 4d и табл.1b). Здесь также разница между ИСТИНОЙ и ЛОЖЬЮ не очень велика (3 раза), но достоверна.

[lib]biocomp_tab_1.jpg[/lib]

Таблица 1. Действие биокомпьютера

а – результаты оценки двух DNF-выражений, полученные для всех комбинаций переменных.
Когда на входе siRNA имеют значения «–» (т.е. отсутствуют), то для одинакового общего количества siRNA во всех экспериментах в качестве негативного контроля использовали соответствующее количество нонсенсной siRNA (не имеющей здесь мишени). Равные количества siRNA вводили в клетки 293-H вместе с равными количествами молекул-операторов, добавляли молекулы контроля трансфекции pAmCyan-C1 (по клеткам, окрашенным красным, судят о том, что трансфекция прошла удачно), и анализировали через 48 часов. Цифры справа показывают суммарную интенсивность флуоресценции белка Zsyellow (зеленого цвета), отнесенную к интенсивности флуоресценции контрольного белка pAmCyan (красного цвета). Совместная экспрессия белков Zsyellow и pAmCyan дает сигналы от красного (при низкой экспрессии ZsYellow) до зеленого или желтого (при достаточно больших количествах ZsYellow).

b – оценка двух CNF-форм.
В эксперименте с формой C1 и репрессором LacI в клетки вводили равные количества siRNA, молекулу-оператор CMV-LacI-FF3-FF4, молекулу-репортер CAGOP-dsRed (кодирующую белок, экспрессию которого регулирует наша схема) и pAmCyan-C1 для контроля трансфекции и анализировали через 48 часов. (CAGOP – сильный промотор бета-актинового белка курицы с LacI операторной областью). Цифры справа показывают интенсивности синтеза (уровни экспрессии) репортера dsRed, отнесенные к контрольным экспериментам, где активные siRNA заменили нонсесными siRNA (первый ряд фотографий).
В эксперименте с формой C1 и репрессором LacI-KRAB в клетки вводили равные количества siRNA, молекулу-оператор CMV-LacI-KRAB-FF3*3-FF4*3, молекулу-репортер CAGOP-dsRed (кодирующую белок, экспрессию которого регулирует наша схема) и pAmCyan-C1 для контроля трансфекции и анализировали через 48 часов, как и в случаях с С1 и LacI.
В эксперименте с формой C2 в клетки вводили одинаковые количества siRNA, равные количества молекул-операторов CMV-LacI-FF3*3 и CMV-LacI-FF4*3, молекулу-репортер CAGOP-dsRed и pAmCyan-C1 трансфекционного контроля и анализировали через 48 часов так же, как и в случае с С1 и LacI. Здесь синий цвет соответствует белку – контролю трансфекции AmCyan, т.к. фотографии делали при других установках микроскопа для лучшего разрешения, а красный – репортерному белку dsRed.

Таким образом, авторы показали, что биокомпьютер, основанный на генных логических схемах, встроенных в человеческие клетки, дает достоверные результаты в ответ на возможные значения пяти молекулярных переменных.

Такие биокомпьютеры, анализирующие входные данные в виде наличия или отсутствия в среде определенных биологических молекул и в качестве сигналов на выходе синтезирующие другие, легко определяемые соединения (в данном случае – фуоресцирующие белки), могут «логически» контролировать биологические процессы в живом организме.

Применение биокомпьютеров в перспективе может быть самым широким – в фундаментальных науках, в фармакологии (для оценки влияния потенциальных лекарственных препаратов на человеческие клетки в культуре) и в медицине – для диагностики различных болезней.

Источник: Keller Rinaudo et al., A universal RNAi-based logic evaluator that operates in mammalian cells. Nature Biotechnology. Published online: 21 May 2007

Дарья Червякова,
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/