Клеточные культуры и микоплазмы

17.06.200552660

В этой статье исключительно практической направленности вы не найдете сведений о способах культивирования эмбриональных и стволовых клеток. Все гораздо проще и доступней, а сама проблема не столь нова и молода. Ей – сорок лет [1].


Культуры клеток и тканей животных широко используются в различных областях биотехнологии, начиная от фундаментальных исследований клетки и молекулярной биологии до бурно развивающихся прикладных направлений. Список различных типов клеток, которые на сегодняшний день могут быть выращены в культуре, весьма обширен. Однако использование клеточных культур осложняется их частой контаминацией микоплазмами и вирусами. По данным [2,3], 99% штаммов микоплазм, выделенных из 1374 клеточных культур, оказались микоплазмами человека, крупного рогатого скота и свиньи. Источники контаминации множественны [4]:


1.  Сыворотка крови крупного рогатого скота

– вследствие несоблюдения правил асептики при взятии крови от животных, слизистые оболочки дыхательного и урогенитального тракта которых обильно колонизированы микоплазмами;

– при фильтрации сыворотки под давлением через фильтры 220 нм отдельные клетки микоплазм, благодаря своей пластичности, проходят через поры, а затем быстро размножаются в клеточных культурах;

– хотя современные фирмы-производители животных сывороток, благодаря применению для стерилизации гамма-облучения, гарантируют потребителям стерильность своей продукции, в т.ч. отсутствие микоплазм и вирусов, риск контаминации вирусами, грибами, микоплазмами достаточно высок.

2.
  Ткани и органы животных и человека – носителей микоплазменной инфекции.

3.
  Работники лабораторий – носители латентной микоплазменной инфекции.

4.
  Инфицированная линия клеток. Если в лаборатории имеется линия клеток, зараженная микоплазмой, то через некоторое время все остальные линии контаминируются этим же видом. Микоплазмы долго (в течение нескольких дней) сохраняются на горлышках флаконов, на плоских поверхностях в боксе и аэрозоле.


Микоплазменная инфекция клеточных культур – повсеместно распространенное явление и обусловливает основные патологические эффекты в клеточной физиологии и метаболизме. Так как клеточные культуры широко используются в научных и промышленных целях, то перед исследователями и практиками встают однотипные вопросы:


– каким методом может быть обнаружена микоплазменная контаминация;
– как эта контаминация влияет на жизнедеятельность клеток;
– какими способами контаминация может быть элиминирована [5].


Обнаружение заражения клеточных культур грибами, вирусами и бактериями не представляет особой трудности, чего нельзя сказать о микоплазмах [6]. Трудности детекции и широкая распространенность контаминированных микоплазмами клеточных культур указывает на то, что эту проблему нельзя игнорировать.


Ранее все сыворотки тестировались на отсутствие микоплазм с помощью метода [7], а также набора MycoTest Kit (Cat. № 062-005672А фирмы GIBCO BRL) [8], вошедшей в состав Invitrogen Corporation.


MycoTest Kit для детекции микоплазменной инфекции клеточных культур снабжен аденозин-фосфорилазой (положительный контроль). Микотест аккуратно и экономно определяет все основные виды микоплазм, включая M.hyorhinis. Исследования проводятся в течение 4-5 дней. Микоплазмы содержат большое количество аденозин-фосфорилазы, которая обнаруживается в очень небольших количествах в животных клетках. Аденозин-фосфорилаза превращает 6-метилпурин деоксирибозид (6-MPDR) – нетоксичный аналог аденозина – в два продукта: 6-метилпурин и 6-метилпурин рибозид. Оба эти продукта токсичны для животных клеток. Инфицированные микоплазмами культуры можно обнаружить посредством инкубирования с 6-MPDR и последующим мониторингом клеточной токсичности. Если присутствуют микоплазмы, аденозин-фосфорилаза превращает 6-MPDR в токсичные продукты, которые приводят к быстрой гибели клеток. Энзим-положительный контроль (аденозин-фосфорилаза) указывает, что анализ проведен корректно, без риска использования живых микоплазм. В состав MycoTest Kit входят:


•  0,65 мл MycoTest (6-MPDR);

•  0,65 мл аденозин-фосфорилазы (положительный контроль);
Для проведения анализа требуются также:

•  индикаторная линия клеток 3Т6 (ATCC CCL96);

•  стерильный PBS, рН 7,2±0,2;

•  краситель 0,2% кристал-виолет в 10% phosphate-buffered formalin, рН7,0±0,2;

•  24-луночные плашки для культуры клеток;

•  микропипетки 0,05-0,2 мл;

•  аспиратор.

NB: Замораживать-оттаивать не больше 2-х раз! На 50 анализов. Хранить при минус 60 – минус 80°С. Срок годности – 12 месяцев.


R.J.Hay предлагает свои методы обнаружения микоплазм в культуре клеток [6], однако они уже морально устарели.


Существуют более современные методы обнаружения этих микроорганизмов. Фирма Sigma предлагает следующие:


1  M1414 Mycoplasma Control Slides.



























Application

For use in Mycoplasma stain kit

ID Clarifier

Cells are grown on coverslips which have been mounted on microscope slides. Use caution when handling control slides as cells are exposed to facilitate staining

Properties

 

storage temp.

2-8°C

Functional testing

Positive/negative Mycoplasma cultures show consistent fluorescence

Expiration date

24 months


2  MYC1 Mycoplasma Stain Kit.



















































Application

Recommended for the detection of Mycoplasma in cell culture

Properties

 

1 kit sufficient for

100 tests

storage temp.

2-8°C

Composition

 

Standard component

Hanks'Balanced Salt Solution without phenol red and sodium bicarbonate: 3?35 mL

Standard component

Hoechst Stain Solution: 10 mL

Standard component

Mounting Medium: 10 mL

Standard component

negative control slides: 10

Standard component

positive control slides: 10

Safety Information

 

Safety Statements

23-24/25


3.  VenorGeM ® Mycoplasma Detection Kit, PCR-based (ПЦР-диагностика).


Существуют коммерческие реагенты, способные излечивать клеточные культуры от микоплазм и вирусов. К сожаленью, один из таких реагентов продается только в Северной и Южной Америке. Это M8190 Mynox®Mycoplasma Elimination Reagent.



































Application

Recommended for the fast and efficient elimination of mycoplasmas in cell culture and virus stocks

Properties

 

sufficient for

2 applications

storage temp.

2-8°C

availability

available only in North America

availability

available only in South America

Safety Information

 

Safety Statements

23-24/25


Риск микробной контаминации значительно уменьшается благодаря применению антибиотиков и ламинарного потока воздуха. Однако культуры должны поддерживаться без антибиотиков насколько это возможно, чтобы не развивалась хроническая, латентная инфекция. Важно проводить тестирование на микоплазмы каждые 1-3 месяца, так как они могут серьезно влиять на биохимию клеток, антигенность и ростовые характеристики линий клеток.


ЛИТЕРАТУРА


1  Encyclopedia of cell technology: John Wiley & Sons Inc. – 2000.

2  Barile M.F. Mycoplasma and cell cultures. – Nat.Cancer Inst. Monogr., 1968. – Dec., 29. – P.201-204.

3  Barile M.F. Mycoplasma infections of cell cultures. //Isr.J.Med.Sci. – 1981. – Jul.17 (7). – P.555-562.

4  Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология. – М.: Медицина. – 1995. – 285с.

5  Rottem S., Barile M.F. Beware of mycoplasmas. //Trends Biotechnol. – 1993. – Apr. 11(4). – P.143-191.

6  Hay R.J. Preservation and Characterisation. In: Animal cell culture. A practical approach. – 1986. - Oxford-Washington DC: IRL PRESS. – P.71-112.

7•  Barile M.F., Kern J. Isolation of Mycoplasma arginini from commercial bovine sera and its implication in contaminated cell cultures. //Proc.Soc.Exp.Biol.Med. – 1971. – Nov., 138 (2). – P.432-437.

8  The Catalogue of Products for Cell Biology and Bioprocessing. GIBCO BRL. Life Technologies.


Анна Шаланда, к.б.н.


Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей