Клеточные культуры и микоплазмы
В этой статье исключительно практической направленности вы не найдете сведений о способах культивирования эмбриональных и стволовых клеток. Все гораздо проще и доступней, а сама проблема не столь нова и молода. Ей – сорок лет [1].
Культуры клеток и тканей животных широко используются в различных областях биотехнологии, начиная от фундаментальных исследований клетки и молекулярной биологии до бурно развивающихся прикладных направлений. Список различных типов клеток, которые на сегодняшний день могут быть выращены в культуре, весьма обширен. Однако использование клеточных культур осложняется их частой контаминацией микоплазмами и вирусами. По данным [2,3], 99% штаммов микоплазм, выделенных из 1374 клеточных культур, оказались микоплазмами человека, крупного рогатого скота и свиньи. Источники контаминации множественны [4]:
1. Сыворотка крови крупного рогатого скота
– вследствие несоблюдения правил асептики при взятии крови от животных, слизистые оболочки дыхательного и урогенитального тракта которых обильно колонизированы микоплазмами;
– при фильтрации сыворотки под давлением через фильтры 220 нм отдельные клетки микоплазм, благодаря своей пластичности, проходят через поры, а затем быстро размножаются в клеточных культурах;
– хотя современные фирмы-производители животных сывороток, благодаря применению для стерилизации гамма-облучения, гарантируют потребителям стерильность своей продукции, в т.ч. отсутствие микоплазм и вирусов, риск контаминации вирусами, грибами, микоплазмами достаточно высок.
2.
Ткани и органы животных и человека – носителей микоплазменной инфекции.
3.
Работники лабораторий – носители латентной микоплазменной инфекции.
4.
Инфицированная линия клеток. Если в лаборатории имеется линия клеток, зараженная микоплазмой, то через некоторое время все остальные линии контаминируются этим же видом. Микоплазмы долго (в течение нескольких дней) сохраняются на горлышках флаконов, на плоских поверхностях в боксе и аэрозоле.
Микоплазменная инфекция клеточных культур – повсеместно распространенное явление и обусловливает основные патологические эффекты в клеточной физиологии и метаболизме. Так как клеточные культуры широко используются в научных и промышленных целях, то перед исследователями и практиками встают однотипные вопросы:
– каким методом может быть обнаружена микоплазменная контаминация;
– как эта контаминация влияет на жизнедеятельность клеток;
– какими способами контаминация может быть элиминирована [5].
Обнаружение заражения клеточных культур грибами, вирусами и бактериями не представляет особой трудности, чего нельзя сказать о микоплазмах [6]. Трудности детекции и широкая распространенность контаминированных микоплазмами клеточных культур указывает на то, что эту проблему нельзя игнорировать.
Ранее все сыворотки тестировались на отсутствие микоплазм с помощью метода [7], а также набора MycoTest Kit (Cat. № 062-005672А фирмы GIBCO BRL) [8], вошедшей в состав Invitrogen Corporation.
MycoTest Kit для детекции микоплазменной инфекции клеточных культур снабжен аденозин-фосфорилазой (положительный контроль). Микотест аккуратно и экономно определяет все основные виды микоплазм, включая M.hyorhinis. Исследования проводятся в течение 4-5 дней. Микоплазмы содержат большое количество аденозин-фосфорилазы, которая обнаруживается в очень небольших количествах в животных клетках. Аденозин-фосфорилаза превращает 6-метилпурин деоксирибозид (6-MPDR) – нетоксичный аналог аденозина – в два продукта: 6-метилпурин и 6-метилпурин рибозид. Оба эти продукта токсичны для животных клеток. Инфицированные микоплазмами культуры можно обнаружить посредством инкубирования с 6-MPDR и последующим мониторингом клеточной токсичности. Если присутствуют микоплазмы, аденозин-фосфорилаза превращает 6-MPDR в токсичные продукты, которые приводят к быстрой гибели клеток. Энзим-положительный контроль (аденозин-фосфорилаза) указывает, что анализ проведен корректно, без риска использования живых микоплазм. В состав MycoTest Kit входят:
0,65 мл MycoTest (6-MPDR);
0,65 мл аденозин-фосфорилазы (положительный контроль);
Для проведения анализа требуются также:
индикаторная линия клеток 3Т6 (ATCC CCL96);
стерильный PBS, рН 7,2±0,2;
краситель 0,2% кристал-виолет в 10% phosphate-buffered formalin, рН7,0±0,2;
24-луночные плашки для культуры клеток;
микропипетки 0,05-0,2 мл;
аспиратор.
NB: Замораживать-оттаивать не больше 2-х раз! На 50 анализов. Хранить при минус 60 – минус 80°С. Срок годности – 12 месяцев.
R.J.Hay предлагает свои методы обнаружения микоплазм в культуре клеток [6], однако они уже морально устарели.
Существуют более современные методы обнаружения этих микроорганизмов. Фирма Sigma предлагает следующие:
1 M1414 Mycoplasma Control Slides.
Application | For use in Mycoplasma stain kit |
ID Clarifier | Cells are grown on coverslips which have been mounted on microscope slides. Use caution when handling control slides as cells are exposed to facilitate staining |
Properties |
|
storage temp. | 2-8°C |
Functional testing | Positive/negative Mycoplasma cultures show consistent fluorescence |
Expiration date | 24 months |
2 MYC1 Mycoplasma Stain Kit.
Application | Recommended for the detection of Mycoplasma in cell culture |
Properties |
|
1 kit sufficient for | 100 tests |
storage temp. | 2-8°C |
Composition |
|
Standard component | Hanks'Balanced Salt Solution without phenol red and sodium bicarbonate: 3?35 mL |
Standard component | Hoechst Stain Solution: 10 mL |
Standard component | Mounting Medium: 10 mL |
Standard component | negative control slides: 10 |
Standard component | positive control slides: 10 |
Safety Information |
|
Safety Statements | 23-24/25 |
3. VenorGeM ® Mycoplasma Detection Kit, PCR-based (ПЦР-диагностика).
Существуют коммерческие реагенты, способные излечивать клеточные культуры от микоплазм и вирусов. К сожаленью, один из таких реагентов продается только в Северной и Южной Америке. Это M8190 Mynox®Mycoplasma Elimination Reagent.
Application | Recommended for the fast and efficient elimination of mycoplasmas in cell culture and virus stocks |
Properties |
|
sufficient for | 2 applications |
storage temp. | 2-8°C |
availability | available only in North America |
availability | available only in South America |
Safety Information |
|
Safety Statements | 23-24/25 |
Риск микробной контаминации значительно уменьшается благодаря применению антибиотиков и ламинарного потока воздуха. Однако культуры должны поддерживаться без антибиотиков насколько это возможно, чтобы не развивалась хроническая, латентная инфекция. Важно проводить тестирование на микоплазмы каждые 1-3 месяца, так как они могут серьезно влиять на биохимию клеток, антигенность и ростовые характеристики линий клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1 Encyclopedia of cell technology: John Wiley & Sons Inc. – 2000.
2 Barile M.F. Mycoplasma and cell cultures. – Nat.Cancer Inst. Monogr., 1968. – Dec., 29. – P.201-204.
3 Barile M.F. Mycoplasma infections of cell cultures. //Isr.J.Med.Sci. – 1981. – Jul.17 (7). – P.555-562.
4 Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология. – М.: Медицина. – 1995. – 285с.
5 Rottem S., Barile M.F. Beware of mycoplasmas. //Trends Biotechnol. – 1993. – Apr. 11(4). – P.143-191.
6 Hay R.J. Preservation and Characterisation. In: Animal cell culture. A practical approach. – 1986. - Oxford-Washington DC: IRL PRESS. – P.71-112.
7 Barile M.F., Kern J. Isolation of Mycoplasma arginini from commercial bovine sera and its implication in contaminated cell cultures. //Proc.Soc.Exp.Biol.Med. – 1971. – Nov., 138 (2). – P.432-437.
8 The Catalogue of Products for Cell Biology and Bioprocessing. GIBCO BRL. Life Technologies.
Анна Шаланда, к.б.н.