Флуоресцентный скрининг фармакологических веществ
3206
0
Н.Л., Институт биофизики
клетки РАН, г. Пущино, Московская область, 142290, e-mail:
nvekshin@rambler.ru
первичного флуоресцентного скрининга лекарств in vitro, позволяющего также предсказывать характеристики
молекулярно-биологических мишеней. Это показано на примере фенотиазинов и
актиномицинов и может быть использовано для значительного числа самых
разнообразных новых лекарств. Метод основан на измерении тушения лекарствами
флуоресценции биополимеров и молекулярных зондов. Он имеет высокую
чувствительность, эффективность, точность и экономичность.
Известно,
что лекарство, вводимое в организм, сначала перераспределяется в мембраны и
другие структуры клетки, после чего оно взаимодействует с «рецептором»
(ферментом, нуклеиновой кислотой и т.п.), расположенным в определенной
клеточной структуре.
Фармакологическое
вещество обычно состоит из: а) полярного фрагмента, позволяющего лекарству
раствориться в крови и в водной фазе клеток; полярный специфический фрагмент
ответственен за контакты с рецепторами; б) неполярного фрагмента, позволяющего
лекарству успешно переходить из водной фазы в клеточные структуры и
аккумулироваться в них.
Флуоресцентные
характеристики фармакологических соединений связаны с количеством и
локализацией в них полярных и неполярных фрагментов. Эти фрагменты
обуславливают способность тушить флуоресценцию биополимеров и зондов. Поэтому
наблюдается хорошая корреляция между фармакологической активностью и флуоресцентными
параметрами [1,2]. Такая корреляция предопределяет возможность успешного
флуоресцентного скрининга медицинских препаратов и предсказания их клеточных
мишеней.
Применимость
метода была проиллюстрирована на примере фенотиазинов [2]. Фенотиазины были
тушителями флуоресценции молекулярного зонда, встроенного в фосфолипидные
липосомы. Измерение зависимости интенсивности флуоресценции зонда от
концентрации тушителя позволяет находить константу связывания
фармакологического вещества с мембраной. В опытах на тринадцати
производных этмозина была показана корреляция между константой тушения
С
целью многократного увеличения чувствительности флуоресцентного анализа были
разработаны специальные многоходовые кюветы [2].
Тушение
флуоресценции зонда может быть связано не только с дезактивацией его
возбужденного состояния лекарственным веществом, но и со стерическим
вытеснением зонда лекарством из гидрофобного «кармана» в нуклеиновой кислоте,
белке или липидном слое.
Такая
конкуренция за место связывания была недавно обнаружена при связывании
антибиотика актиномицина-D AMD и его флуоресцирующего аналога
7-аминоактиномицина (7AAMD) со шпильками ДНК [3]. Была также показана
корреляция между связыванием актиномицинов и их спектральными параметрами.
В
то же время было продемонстрировано принципиальное различие некоторых свойств
AMD и 7AAMD в отношении ДНК. В больших концентрациях 7AAMD индуцирует
денатурацию ДНК. В комплексе с AMD молекула ДНК сохраняется в нативной В-форме.
Кроме того,
была показана зависимость связывания актиномицинов от природы нуклеиновой
кислоты или олигонуклеотида.
1. Szent-Gyorgyi A. Introduction to Submolecular Bioligy. London, 1960.
2. Vekshin N.L. Photonics of Biopolymers.
3. Савинцев И. В., Векшин Н. Л. // Мол.биол., 2002, т.36, № 4, с.725-730.
Зеркальные кюветы для спектрофлуориметрии
предназначены для измерения флуоресценции слабопоглощающих растворов. Они могут
быть использованы при физико-химических и медико-биологических исследованиях,
чтобы регистрировать спектры возбуждения и излучения в видимой и УФ области, а
также для детектирования время жизни возбужденного состояния.
интенсивности флуоресценции благодаря увеличению длины оптического пути
возбуждающего света и добавочному светосбору излучения.
так, что возбуждающий свет отражается алюминиевым слоем, нанесенным на внешние
стороны кварцевой ячейки и покрытым снаружи защитным слоем. Возбуждающий свет, входящий
через узкое окошко во фронтальной зеркальной стенке кюветы, проходит через
раствор и попадает на зеркальную противоположную сторону, отклоняется и
подвергается двум или трем отражениям внутри кюветы. Излучение собирается под
прямым углом. Дополнительный светосбор излучения обеспечивается зеркальной
боковой стенкой, направляющей флуоресценцию в канал регистрации. Зеркальная
кювета дает 3-5-кратное усиление флуоресценции. При использовании этой кюветы
световые потери и артефактная поляризация минимальны по сравнению с обычной
кюветой, расположенной около вогнутых зеркал. Зеркальная кювета может быть
использована без каких-либо модификаций в любых спектрофлуориметрах.
позволяет использовать малые количества растворов (0,2 – 0,5 мл) и обеспечивает
3-кратное увеличение интенсивности флуоресценции. Эта кювета фиксируется в
специальном держателе, адаптированном под все коммерческие спектрофлуориметры.
[lib]kuv1.jpg[/lib]
Рис.1. Зеркальная
кювета (1) и кювета полного внутреннего отражения (2)
[lib]kuv2.jpg[/lib]
Рис. 2. Флуоресценция
зонда АНС (в этаноле) в стандартной кювете (1) и в зеркальной кювете (2)
В кювете
ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ возбуждающий свет входит через узкое окошко в
боковой части фронтальной грани и отражается четыре-шесть раз на границе кварц /
воздух с помощью двух наружных приклеенных призм, а боковая зеркальная грань
направляет излучение в канал регистрации. Эта кювета обеспечивает 4-8-кратное
усиление интенсивности, если используется параллельный (лазерный) возбуждающий
пучок.
Многоходовые кюветы изготавливаются из
высококачественного кварца в Центре биологических исследований в Пущино. Они
успешно используются во многих лабораториях России, США, Канады, Франции, Германии,
Голландии и Японии. Цена этих кювет
импортные кюветы. С заказами обращайтесь: Векшин Н.Л., Институт биофизики клетки РАН, 142290, г. Пущино, Моск.
обл.
style='font-size:11.0pt;mso-bidi-font-size:10.0pt;mso-ansi-language:EN-US'>E
различные флуориметрические и фотометрические кюветы и микрокюветы, линзы,
интерференционные светофильтры, призмы, лампы и т.п.
Патенты РФ № 1254357 и 1312452.
Векшин Н.Л. Оптическая техника, 1994, № 3, с.18-20.
Web-site: http://photonics.narod.ru
