Новый метод изучения функционирования нервных клеток

Ученые из Института Солка (Salk Institute) с помощью методов генной инженерии научились вводить в нейральные стволовые клетки «неестественные» аминокислоты, например, аминокислоты, обуславливающие зеленую флуоресценцию клеток. Затем нейральные стволовые клетки были дифференцированы в нейроны, сохранявшие святящуюся «метку».

Новая методика, недавно опубликованная в журнале Stem Cells, поможет ученым исследовать различные типы стволовых клеток человека, а также их дифференцированные производные. Метод положительно повлияет и на фундаментальные, и на клинические исследования, например, ускорив развитие регенеративной медицины, в которой применяются стволовые клетки.

«Стволовые клетки сохраняют большой потенциал в качестве метода лечения пациентов с различными заболеваниями, однако до сих пор было трудно изучать процессы их самообновления и образования из них остальных клеток организма. Возможность с помощью генетических методов включать «неестественные» аминокислоты в состав белков стволовых клеток приблизит нас к понимаю биохимических сигнальных путей, контролирующих функционирование этих клеток. Глубокое понимание описываемых механизмов имеет решающее значение при разработке безопасных и надежных методов терапии стволовыми клетками», - рассказывает руководитель исследования доктор Ли Ванг (Lei Wang).

«Методика внедрения «неестественных» аминокислот, в отличие от традиционных биохимических методов, которые проводятся в пробирке в условиях in vitro, позволяет ученым изучать определенный белок непосредственно в живой клетке или организме», - добавил другой участник исследования, доктор Бин Шен (Bin Shen).

Метод внедрения «неестественных» аминокислот или Uaas (от англ. «unnatural amino acids») в геном клетки был разработан доктором Ли Вангом и его коллегами и впервые апробирован на бактериях в 2001 г., а на клетках млекопитающих – в 2007 г. В новом исследовании, проведенном совместно химиками, молекулярными и клеточными биологами, метод был впервые применен к стволовым клеткам человека. Исследование проходило в две стадии.

Задачей первой стадии было установить, возможно ли ввести Uaas в нейральные стволовые клетки без нарушения процесса их дифференцировки, а также выявить, будет ли передаваться введенная в стволовые клетки флуоресцентная метка их потомкам – нервным клеткам (нейронам).

«Разработанный ранее метод внедрения Uaas в клетки не подходит для стволовых клеток, потому что введенные гены обычно теряются до момента завершения дифференцировки», - объяснил Ванг.

Для решения этой проблемы ученые разработали специальный метод лентивирусного внедрения генов с целью включения Uaas в число генов, белковые продукты которых экспрессируются нейральными стволовыми клетками. «Методика лентивирусной генной трансфекции, впервые предложенная доктором Индером Верма (Inder Verma) из Института Солка, обеспечивает долгосрочную экспрессию генов во время всего периода дифференцировки стволовых клеток», - пояснил доктор Ванг.

Вирусный вектор был использован для доставки генов различных молекулярных компонентов, необходимых для введения Uaas в белки клетки. В число внедряемых компонентов входила синтетическая транспортная РНК (тРНК), которая необходима клеткам для включения аминокислот в состав белков. Вторым компонентом был фермент синтаза, связывающий сконструированную учеными тРНК и соединяющий ее с третьим компонентом – «неестественной» аминокислотой. «Неестественные» аминокислоты создаются в условиях лаборатории, химически отличаются от «естественных» 20 аминокислот, входящих в состав белков живых организмов, и могут обладать различными заданными свойствами – например, способностью к флуоресценции.

«Если вы получили линию стволовых клеток, содержащих Uaas, то вы можете использовать в их изучении флуоресцентную метку. У вас также будет возможность путем дифференцировки получать различные взрослые клетки, несущие такую же метку, например, нейроны, в которые сложно вводить Uaas», - сказал доктор Ванг.

Результаты первой серии экспериментов показали, что Uaas были успешно внедрены в нейральные стволовые клетки. После включения «неестественной» аминокислоты дифференцировка клеток продолжилась.

Данные, полученные во второй части экспериментов, свидетельствуют о том, что Uaas можно использовать для решения различных биологических задач. Ученые хотели узнать, как потенциал-зависимые ионные каналы, образованные специальными белками, функционируют в нейронах. Ионные каналы необходимы нейронам для генерации потенциала действия на мембране и осуществления межнейронной коммуникации посредством электрических импульсов. «Мы пытаемся понять, каким образом электрическое поле клеточных мембран может включать или выключать функции белков», – сказал Ванг.

Для изучения этого феномена исследователи включили флуоресцирующую аминокислоту в [url=http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%94%D0%BE%D0%BC%D0%B5%D0%BD_(%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F)]белковый домен[/url], который ионные каналы и другие белки используют для восприятия электрического поля, создаваемого нейронами, в которые также была включена искусственная аминокислота. После этого экспериментаторы смогли наблюдать в режиме реального времени изменения и перемещения флуоресцентной метки при прохождении электрического потока через нейрон.


Фотография нейронов, дифференцированных из нейральных стволовых клеток линии HCN-A94 с внедренной «неестественной» аминокислотой (Фото: Доктор Bin Shen).

По материалам:
Salk Institute

Оригинальная статья:
Bin Shen, Zheng Xiang, Barbara Miller, Gordon Louie, Wenyuan Wang, Joseph P. Noel, Fred H. Gage, Lei Wang. Genetically Encoding Unnatural Amino Acids in Neural Stem Cells and Optically Reporting Voltage-Sensitive Domain Changes in Differentiated Neurons. STEM CELLS, 2011; DOI: [url=http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.679/abstract;jsessionid=BDCAEADFFFA933AF7E6D12336C8A4620.d01t01]10.1002/stem.679[/url]