К вопросу о терапевтическом клонировании
23.02.2008
6770
0
67700
Клонирование клеток человека методом переноса ядер соматических клеток: прогресс и перспективы.
Метод переноса ядер соматических клеток (ПЯСК) в стволовые клетки имеет существенные преимущества перед методом индукции репрограммирования, когда необходимо получить стволовые клетки, генетически идентичные клеткам определенного индивидуума. Обсуждаются последние достижения в этой области и основные препятствия на пути формирования культур стволовых клеток человека, полученных методом ПЯСК.
Получение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), специфичных для данного пациента, стало бы прорывом в клеточной терапии многих заболеваний человека и позволило бы разработать новые средства лечения и предотвращения прогрессии заболеваний [1]. В настоящее время известно два способа получения стволовых клеток, несущих генетический материал пациента (см. рисунок): метод терапевтического клонирования с помощью ПЯСК (somatic cell nuclear transfer, SCNT) и индукция репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки (способные давать начало клеткам всех типов тканей зародыша и взрослого организма, а также внезародышевых или провизорных органов), сходные по своим свойствам с ЭСК (в т.н. индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – иПС клетки; induced pluripotent stem cells, iPS cells) [2, 3].
Получение индивидуальных стволовых клеток человека для изучения патогенеза наследственных заболеваний, роли мтДНК, эпигенетических и генетических профилей, процессов дифференцировки, механизмов поддержания плюрипотентности и перспектив применения стволовых клеток. Сокращения: чЭСК – человеческие эмбриональные стволовые клетки; ПЯСК – перенос ядра соматической клетки; иПС клетки – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; МII – метафазаII; мтДНК – митохондриальная ДНК.
При ПЯСК ядро из соматической клетки пациента переносят в цитоплазму энуклеированного ооцита, находящегося в метафазе второго деления мейоза (иными словами, в неоплодотворенную яйцеклетку в метафазе II, собственное ядро которой было предварительно удалено). Развивающийся из такой яйцеклетки эмбрион будет генетически идентичен донору ядра, т.е. будет его клоном. Клетки инкубируют до стадии образования бластоцисты (зародыша, который формируется к пятому дню оплодотворения), из внутренней клеточной массы которой выделяют клонированные ЭСК и исследуют свойства полученных клеточных культур.
[url=http://www.cbio.ru/modules/sections/index.php?op=viewarticle&artid=3164Р/]Индукция репрограммирования[/url] соматических клеток человека в плюрипотентные стволовые клетки происходит при внедрении в клетки исходной культуры так называемых генов плюрипотентности, способных вернуть взрослые клетки в эмбриональное состояние. Схема репрограммирования основана на инфицировании культуры соматических клеток человека ретровирусами, несущими набор из четырех генов: Oct4, Sox2, c-myc и Klf4 или Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Гены Oct4 и Sox2 кодируют ключевые белки, необходимые для пролиферации (деления) и поддержания плюрипотентности стволовых клеток. Продукты генов c-myc и Klf4 способствуют активации Oct4 и Sox2. Ген c-myc является также протоонкогеном, т.е. при его гиперэкспрессии может происходить злокачественная трансформация нормальных клеток. Продукт гена Nanog необходим для индукции плюрипотентности соматических клеток. В последних исследованиях [3] была показана целесообразность замены Klf4 и c-myc на Nanog и Lin28. Дальнейшую селекцию культур иПС клеток проводят по соответствию морфологических (компактность колоний, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, четкая визуализация ядер), иммуногистохимических и генетических характеристик с ЭСК человека.
Равноценность получения стволовых клеток методами ПЯСК и иПС вызывает сомнения. Применение в клеточной терапии методик, основанных на использовании ретровирусной трансфекции и внесения в клетки протоонкогенов, может представлять опасность [4, 5]. Несмотря на то, что сторонники метода иПС уверяют, что указанные проблемы носят технический характер и легко преодолимы, сторонники ПЯСК считают необходимым ускорить исследования в наиболее спорных направлениях (как, например, использование яйцеклеток человека в ПЯСК) для скорейшего внедрения методики переноса ядра, как наиболее перспективной и безопасной.
Клонирование эмбрионов человека с помощью ПЯСК остается в «зачаточном» состоянии, что иллюстрируется немногочисленными публикациями по этой теме [6-11]. Ни в одной из этих работ не удалось получить методом ПЯСК стволовые клетки человека, содержащие перенесенные ядра пациентов. Проведение экспериментов с использованием яйцеклеток человека затрудняют проблемы этического характера, связанные с получением разрешений регулирующих органов. Основным препятствием для таких исследований является нехватка добровольно пожертвованных ооцитов в метафазе II мейоза [8-10]. Успех процедуры ПЯСК на клетках человека напрямую зависит от качества используемых в эксперименте ооцитов: они должны быть свежими, зрелыми, и полученными от молодого донора [8-12]. Последнее требование сильно ограничивает доступность ооцитов, а выбор оптимальной методологии становится абсолютно необходимым для осуществления ПЯСК на клетках человека.
Одна группа исследователей называет два решающих фактора формирования культур стволовых клеток приматов, полученных методом ПЯСК [13]: это удаление минимального количества цитоплазмы во время энуклеации и визуализация клеток без использования красителей с помощью микроскопа «Oosight», позволяющего непосредственно наблюдать за мейотическим веретеном деления во время энуклеации. Другие ученые показали, что энуклеация яйцеклеток традиционными методами, основанными на окрашивании флуоресцентным красителем Hoechst, связывающимся с ДНК, не снижает эффективности клонирования клеток человека методом ПЯСК [12]. Авторы заключили, что скорость лизиса (разрушения) ооцитов была одинакова в обоих методах, а увеличение времени обработки ооцитов цитохалазином-В (сглаживающим мембраны ооцитов и облегчающим введение микроигл при энуклеации) до 45 минут уменьшало степень лизиса ооцитов.
Идентифицировать истинные клоны, полученные методом ПЯСК, можно с помощью дактилоскопии (или ДНК-фингерпринтинга) геномной и митохондриальной ДНК (мтДНК) эмбрионов и стволовых клеток, полученных методом ПЯСК [14-16]. Метод ДНК-дактилоскопии основан на природном полиморфизме определенных участков генома индивидуумов, и выполняется с использованием радиоактивно-меченых зондов или ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Группа ученых под руководством French A.J. получила с помощью ПЯСК пять бластоцист из 21 ооцита [12]. Дактилоскопия геномной ДНК и мтДНК сформировавшихся бластоциcт выявила среди них единственный эмбрион, имеющий геномную ДНК соматической клетки-донора и мтДНК ооцита. В настоящее время эффективность получения стволовых клеток человека методом ПЯСК ничтожно мала.
Разработка методик формирования линий стволовых клеток человека, несущих генетический материал пациента (полученных методом ПЯСК), откроет широкие перспективы для дальнейших исследований в области клеточной терапии.
По материалам:
Cervera R.P., Stojkovic M. Somatic Cell Nuclear Transfer:Progress and Promise. Stem Cells published online Jan 17, 2008.
Список литературы:
1. Cervera RP, Stojkovic M. Human embryonic stem cell derivation and nuclear transfer: impact on regenerative therapeutics and drug discovery. Clin Pharmacol Ther 2007;82:310-5.
2. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-72.
3. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007;318:1917-20.
4. Loewer R. The pathogenic potential of endogenous retroviruses: facts and fantasies. Trends Microbiol 1999;7:350-6.
5. Yi Y, Hahm SH, Lee KH. Retroviral gene therapy: safety issues and possible solutions. Curr Gene Ther 2005;5:25-35.
6. Cibelli JB, Kiessling AA, Cuniff K et al. Somatic cell nuclear transfer in humans: pronuclear and early embryonic development. J Reg Med 2001;2:25-31.
7. Lu C, Lin G, Xie X et al. Reconstruction of human embryos derived from somatic cells. Chin Science Bull 2003;48:1840-3.
8. Stojkovic M, Stojkovic P, Leary C et al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes. Reprod Biomed Online 2005;11:226-31.
9. Lavoir MC, Weier J, Conaghan J et al. Poor development of human nuclear transfer embryos. Reprod Biomed Online 2005:11:740-4.
10. Hall VJ ,Compton D, Stojkovic P et al. Developmental competence of human in vitro aged oocytes as host cells for nuclear transfer. Hum Reprod 2007;22:52-62.
11. Heindryckx B, De Sutter P, Gerris J et al. Embryo development after successful somatic cell nuclear transfer to in vitro matured human germinal vesicle oocytes. Hum Reprod 2007;22:1982-90.
12. French AJ, Adams CA, Anderson LS et al. Development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer (SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells 2008; in press.
13. Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007;450:497-502.
14. Yang X, Eggan K, Seidel Jr. G et al. A simple system of checks and balances to cut fraud. Nature 2006;439:782.
15. Cram DS, Song B, Trounson AO. Genotyping of Rhesus SCNT pluripotent stem cell lines. Nature 2007;450:E12-4.
16. Kim K, Ng K, Rugg-Gunn PJ et al. Recombination signatures distinguish embryonic stem cells derived by parthenogenesis and somatic cell nuclear transfer. Cell Stem Cell 2007;1:346-52.
Перевод: Дарья Червякова,
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология»
Метод переноса ядер соматических клеток (ПЯСК) в стволовые клетки имеет существенные преимущества перед методом индукции репрограммирования, когда необходимо получить стволовые клетки, генетически идентичные клеткам определенного индивидуума. Обсуждаются последние достижения в этой области и основные препятствия на пути формирования культур стволовых клеток человека, полученных методом ПЯСК.
Получение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), специфичных для данного пациента, стало бы прорывом в клеточной терапии многих заболеваний человека и позволило бы разработать новые средства лечения и предотвращения прогрессии заболеваний [1]. В настоящее время известно два способа получения стволовых клеток, несущих генетический материал пациента (см. рисунок): метод терапевтического клонирования с помощью ПЯСК (somatic cell nuclear transfer, SCNT) и индукция репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки (способные давать начало клеткам всех типов тканей зародыша и взрослого организма, а также внезародышевых или провизорных органов), сходные по своим свойствам с ЭСК (в т.н. индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – иПС клетки; induced pluripotent stem cells, iPS cells) [2, 3].
Получение индивидуальных стволовых клеток человека для изучения патогенеза наследственных заболеваний, роли мтДНК, эпигенетических и генетических профилей, процессов дифференцировки, механизмов поддержания плюрипотентности и перспектив применения стволовых клеток. Сокращения: чЭСК – человеческие эмбриональные стволовые клетки; ПЯСК – перенос ядра соматической клетки; иПС клетки – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; МII – метафазаII; мтДНК – митохондриальная ДНК.
При ПЯСК ядро из соматической клетки пациента переносят в цитоплазму энуклеированного ооцита, находящегося в метафазе второго деления мейоза (иными словами, в неоплодотворенную яйцеклетку в метафазе II, собственное ядро которой было предварительно удалено). Развивающийся из такой яйцеклетки эмбрион будет генетически идентичен донору ядра, т.е. будет его клоном. Клетки инкубируют до стадии образования бластоцисты (зародыша, который формируется к пятому дню оплодотворения), из внутренней клеточной массы которой выделяют клонированные ЭСК и исследуют свойства полученных клеточных культур.
[url=http://www.cbio.ru/modules/sections/index.php?op=viewarticle&artid=3164Р/]Индукция репрограммирования[/url] соматических клеток человека в плюрипотентные стволовые клетки происходит при внедрении в клетки исходной культуры так называемых генов плюрипотентности, способных вернуть взрослые клетки в эмбриональное состояние. Схема репрограммирования основана на инфицировании культуры соматических клеток человека ретровирусами, несущими набор из четырех генов: Oct4, Sox2, c-myc и Klf4 или Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Гены Oct4 и Sox2 кодируют ключевые белки, необходимые для пролиферации (деления) и поддержания плюрипотентности стволовых клеток. Продукты генов c-myc и Klf4 способствуют активации Oct4 и Sox2. Ген c-myc является также протоонкогеном, т.е. при его гиперэкспрессии может происходить злокачественная трансформация нормальных клеток. Продукт гена Nanog необходим для индукции плюрипотентности соматических клеток. В последних исследованиях [3] была показана целесообразность замены Klf4 и c-myc на Nanog и Lin28. Дальнейшую селекцию культур иПС клеток проводят по соответствию морфологических (компактность колоний, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, четкая визуализация ядер), иммуногистохимических и генетических характеристик с ЭСК человека.
Равноценность получения стволовых клеток методами ПЯСК и иПС вызывает сомнения. Применение в клеточной терапии методик, основанных на использовании ретровирусной трансфекции и внесения в клетки протоонкогенов, может представлять опасность [4, 5]. Несмотря на то, что сторонники метода иПС уверяют, что указанные проблемы носят технический характер и легко преодолимы, сторонники ПЯСК считают необходимым ускорить исследования в наиболее спорных направлениях (как, например, использование яйцеклеток человека в ПЯСК) для скорейшего внедрения методики переноса ядра, как наиболее перспективной и безопасной.
Клонирование эмбрионов человека с помощью ПЯСК остается в «зачаточном» состоянии, что иллюстрируется немногочисленными публикациями по этой теме [6-11]. Ни в одной из этих работ не удалось получить методом ПЯСК стволовые клетки человека, содержащие перенесенные ядра пациентов. Проведение экспериментов с использованием яйцеклеток человека затрудняют проблемы этического характера, связанные с получением разрешений регулирующих органов. Основным препятствием для таких исследований является нехватка добровольно пожертвованных ооцитов в метафазе II мейоза [8-10]. Успех процедуры ПЯСК на клетках человека напрямую зависит от качества используемых в эксперименте ооцитов: они должны быть свежими, зрелыми, и полученными от молодого донора [8-12]. Последнее требование сильно ограничивает доступность ооцитов, а выбор оптимальной методологии становится абсолютно необходимым для осуществления ПЯСК на клетках человека.
Одна группа исследователей называет два решающих фактора формирования культур стволовых клеток приматов, полученных методом ПЯСК [13]: это удаление минимального количества цитоплазмы во время энуклеации и визуализация клеток без использования красителей с помощью микроскопа «Oosight», позволяющего непосредственно наблюдать за мейотическим веретеном деления во время энуклеации. Другие ученые показали, что энуклеация яйцеклеток традиционными методами, основанными на окрашивании флуоресцентным красителем Hoechst, связывающимся с ДНК, не снижает эффективности клонирования клеток человека методом ПЯСК [12]. Авторы заключили, что скорость лизиса (разрушения) ооцитов была одинакова в обоих методах, а увеличение времени обработки ооцитов цитохалазином-В (сглаживающим мембраны ооцитов и облегчающим введение микроигл при энуклеации) до 45 минут уменьшало степень лизиса ооцитов.
Идентифицировать истинные клоны, полученные методом ПЯСК, можно с помощью дактилоскопии (или ДНК-фингерпринтинга) геномной и митохондриальной ДНК (мтДНК) эмбрионов и стволовых клеток, полученных методом ПЯСК [14-16]. Метод ДНК-дактилоскопии основан на природном полиморфизме определенных участков генома индивидуумов, и выполняется с использованием радиоактивно-меченых зондов или ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Группа ученых под руководством French A.J. получила с помощью ПЯСК пять бластоцист из 21 ооцита [12]. Дактилоскопия геномной ДНК и мтДНК сформировавшихся бластоциcт выявила среди них единственный эмбрион, имеющий геномную ДНК соматической клетки-донора и мтДНК ооцита. В настоящее время эффективность получения стволовых клеток человека методом ПЯСК ничтожно мала.
Разработка методик формирования линий стволовых клеток человека, несущих генетический материал пациента (полученных методом ПЯСК), откроет широкие перспективы для дальнейших исследований в области клеточной терапии.
По материалам:
Cervera R.P., Stojkovic M. Somatic Cell Nuclear Transfer:Progress and Promise. Stem Cells published online Jan 17, 2008.
Список литературы:
1. Cervera RP, Stojkovic M. Human embryonic stem cell derivation and nuclear transfer: impact on regenerative therapeutics and drug discovery. Clin Pharmacol Ther 2007;82:310-5.
2. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-72.
3. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007;318:1917-20.
4. Loewer R. The pathogenic potential of endogenous retroviruses: facts and fantasies. Trends Microbiol 1999;7:350-6.
5. Yi Y, Hahm SH, Lee KH. Retroviral gene therapy: safety issues and possible solutions. Curr Gene Ther 2005;5:25-35.
6. Cibelli JB, Kiessling AA, Cuniff K et al. Somatic cell nuclear transfer in humans: pronuclear and early embryonic development. J Reg Med 2001;2:25-31.
7. Lu C, Lin G, Xie X et al. Reconstruction of human embryos derived from somatic cells. Chin Science Bull 2003;48:1840-3.
8. Stojkovic M, Stojkovic P, Leary C et al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes. Reprod Biomed Online 2005;11:226-31.
9. Lavoir MC, Weier J, Conaghan J et al. Poor development of human nuclear transfer embryos. Reprod Biomed Online 2005:11:740-4.
10. Hall VJ ,Compton D, Stojkovic P et al. Developmental competence of human in vitro aged oocytes as host cells for nuclear transfer. Hum Reprod 2007;22:52-62.
11. Heindryckx B, De Sutter P, Gerris J et al. Embryo development after successful somatic cell nuclear transfer to in vitro matured human germinal vesicle oocytes. Hum Reprod 2007;22:1982-90.
12. French AJ, Adams CA, Anderson LS et al. Development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer (SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells 2008; in press.
13. Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007;450:497-502.
14. Yang X, Eggan K, Seidel Jr. G et al. A simple system of checks and balances to cut fraud. Nature 2006;439:782.
15. Cram DS, Song B, Trounson AO. Genotyping of Rhesus SCNT pluripotent stem cell lines. Nature 2007;450:E12-4.
16. Kim K, Ng K, Rugg-Gunn PJ et al. Recombination signatures distinguish embryonic stem cells derived by parthenogenesis and somatic cell nuclear transfer. Cell Stem Cell 2007;1:346-52.
Перевод: Дарья Червякова,
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология»
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Последние комментарии
