ДНК-наноструктуры и анализ экспрессии генома – от теории к практике

16.01.200831120
Исследователи из Аризонского Института Биотехнологии (Arizona State University’s Biodesign Institute) (США) разработали первую в мире систему детекции экспрессии генов, основанную на самоорганизующихся ДНК-наноструктурах. Результаты, опубликованные в январе 2008 года в журнале Science, могут получить широкое применение в сфере микрочиповых технологий и анализа генной экспрессии в отдельно взятой клетке.

«В качестве наноструктурного ”строительного материала” мы использовали наиболее известную в современной биологии молекулу – ДНК», объяснил Гао Ян (Hao Yan), работающий в лаборатории Биофизики Клетки Аризонского Института Биотехнологии. Область его исследований – быстро развивающиеся сейчас структурные ДНК-нанотехнологии. Это направление, находящееся на стыке биологии, физики и кибернетики, занимается в основном включением молекул ДНК в разнообразные наноструктуры, имеющие весьма широкое применение: от медицины до наноэлектроники.

Гао Ян возглавил группу исследователей, чья работа была направлена на разработку метода, позволяющего с помощью ДНК выявить продукты экспрессии отдельных генов в клетке, то есть молекулы РНК.

«Это первая успешная попытка практического применения мощного метода, который до настоящего времени был в основном предметом фундаментальной науки», говорит один из исследователей, Стюарт Линдсей (Stuart Lindsay), «в последнее время мы добились существенного прогресса в конструировании геометрических и топологических наноструктур, основанных на свойстве самоорганизации ДНК, изначально продемонстрированном Недом Симаном (Ned Seeman), Эриком Уинфри (Erik Winfree) и их коллегами».

Идея создания определенным образом пространственно организованных ДНК-наноматриц пришла из работ Пола Ротмунда (Paul Rothemund), который создал метод «ДНК-оригами» (в оригинале: scaffolded DNA origami). Это метод, в котором длинные одноцепочечные нити вирусной ДНК могут быть определенным образом уложены и скреплены с помощью так называемых «вспомогательных нитей» в регулярные наноструктуры.



ДНК-оригами
С высокой точностью контролируя положение каждого азотистого основания в синтетической ДНК, исследователи запрограммировали одноцепочечную ДНК М13 формировать в растворе наноцилиндры, содержащие пробы для гибридизации с анализируемой РНК. Два фрагмента пробы находятся на поверхности цилиндров, и, когда РНК связывается с их свободными концами, образуется жесткая структура. Ядерно-силовая микроскопия позволяет получить изображения проб с молекулярным разрешением. Места гибридизации образуют выпуклости на цилиндрах, которые выглядят на фотографии как светлые полосы (подробное объяснение см. в тексте).


«Однако потенциал ДНК-нанотехнологий для биологических исследований был недооценен. Если мы внимательно посмотрим на процесс самоорганизации молекул ДНК, то увидим, что в нескольких микролитрах раствора могут одновременно формироваться миллионы ДНК-наноструктур. Важно то, что они остаются растворимыми, а также что они биосовместимы», говорит Ян.

Сегодня для анализа экспрессии генов применяется ДНК-микрочиповая технология (в оригинале: DNA chip- или DNA-microarray technology). С ее помощью можно одновременно анализировать тысячи генов, определяя их мутации и обнаруживая причины различных патологий. Однако в случае микрочипа фрагменты ДНК фиксируются на твердой стеклянной или кремниевой подложке. В результате этого очень сложно точно контролировать расстояние между пробами, что приводит к увеличению времени гибридизации проб с анализируемыми образцами РНК или ДНК, повышению вероятности нежелательной кросс-гибридизации и, как результат, к снижению точности метода.

В случае ДНК-наноматрицы она одновременно является и носителем пробы, и самой пробой. Это позволяет добиться как более высокой разрешающей способности метода, так и более высокой точности анализа.

Исследователи синтезировали одноцепочечную геномную ДНК, М13, которая формировала наноразмерные цилиндры, содержащие пробы отдельных интересующих исследователей генов. Такой структуры можно добиться, контролируя при синтезе ДНК последовательность азотистых оснований в молекуле. Фактически, Гао Ян и коллеги использовали основной закон образования пар нуклеотидов в двуцепочечной молекуле ДНК: аденин формирует ковалентные связи с тимином, а гуанин – с цитозином. При попадании одноцепочечной молекулы с определенной последовательностью неклеотидов в раствор, она предсказуемым образом «сворачивается», образуя внутренние связи. М13 практически в 100% случаев образует идентичную цилиндрическую структуру.

Гао Ян с коллегами разработали на данный момент систему для детекции экспрессии трех генов. Каждая проба может быть отличена от другой с помощью структурных «опознавательных знаков», поэтому исследователи смешали все три пробы в одном растворе, получив, таким образом, единую систему для выявления нескольких РНК-продуктов. Для выявления гибридизации исследователи использовали ядерно-силовую микроскопию (от англ. atomic force microscopy (AFM)), позволяющую получить изображения отдельных молекул в растворе.



ДНК-наноматрицы
Слева – ДНК-наноматрицы после гибридизации с исследуемой РНК. Размер поля: 1500 х 1500 нм. Справа – фотография с более высоким разрешением, на которой отчетливо видны «опознавательные знаки», позволяющие отличить одну матрицу от другой (светлые точки).


На поверхности каждого ДНК-цилиндра находился фрагмент одноцепочечной ДНК-пробы, с которой связывалась РНК гена из образца. «В сущности, на поверхности наноцилиндра находилось два фрагмента пробы, концы которых были не закреплены и находились в растворе. При связывании обоих фрагментов с интересующей нас РНК структура становится жесткой. На изображении, получаемом с микроскопа, мы видим место гибридизации как светлую линию. В сущности, это физический метод, не требующий использования сложных химических систем визуализации», пояснил Гао Ян.

Разрешение нового метода позволяет выявить исчезающее малые концентрации РНК. «Поскольку гибридизация РНК с ДНК очень высокоаффинна, то есть с высокой вероятностью образуются ковалентные связи, то теоретически можно выявлять единичные молекулы продуктов экспрессии интересующих генов».

Несмотря на то, что в методе осталось еще немало технических сложностей, потенциал его применения весьма высок. «С помощью нашей технологии объем исследуемого раствора можно сократить до объема отдельно взятой клетки. Наша цель – научиться выявлять экспрессию генов на уровне одной клетки».



ДНК-наноархитекторы
Исследователи Йонгганг Ке (Yonggang Ke) (слева) и Гао Ян (Hao Yan) (справа), создатели нового метода определения экспрессии генов.


По материалам:
Arizona State University

Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей