Создание костной ткани из собственных клеток пациента является важной задачей тканевой инженерии и представляет практический интерес для медицины и ветеринарии.

Основная идея генерации новой кости проста. Из биосовместимого материала делают заготовку, имеющую форму будущей кости. В систему вносят клетки-предшественники костной ткани, которые со временем должны заселить весь объем заготовки. Чтобы клетки росли и развивались, добавляют сигнальные молекулы, факторы дифференцировки и роста клеток кости. Если все условия подобраны правильно, со временем на месте заготовки образуется кость, по прочности и другим характеристикам очень похожая на настоящую.

В качестве клеток-предшественников костной ткани используют мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые находятся, например, в костном мозге каждого человека. Эти клетки в соответствующих условиях могут дифференцироваться в клетки разных типов: жировые, костные, хрящевые, мышцы, клетки соединительной ткани. Для правильного формирования кости необходимо, чтобы МСК дифференцировались в остеогенные клетки, которые в дальнейшем разовьются в зрелые клетки костной ткани – остеобласты и остеоциты.

Однако даже у такого замечательного подхода имеется ряд нерешенных проблем. Например, факторы, стимулирующие образование кости, для каждого пациента должны подбираться индивидуально, с учетом возраста, пола и т.п. Другая трудность заключается в том, что зачастую МСК формируют вокруг заготовки мягкие ткани, прежде чем успеют дифференцироваться в клетки кости и прорасти внутрь.

Группа ученых из Великобритании задумалась над тем, как заставить МСК дифференцироваться в клетки костной ткани без применения химических воздействий. Известно, что дифференцировка МСК in vitro зависит от особенностей подложки, на которой они растут, однако у разных исследователей получались противоречивые результаты. В целом считается, что более шероховатая подложка способствует лучшей дифференцировке клеток костной ткани, однако в некоторых случаях бывает и наоборот.

Британские ученые предположили, что все дело в наноразмерных особенностях шероховатой поверхности. Чтобы проверить свою догадку, они изготовили при помощи метода электронно-лучевой литографии (electron beam lithography, EBL) различные подложки из полиметилметакрилата (PMMA), на которых определенным образом располагались лунки 120 нм в диаметре и 100 нм глубиной. Расстояние между лунками составляло в среднем 300 нм. Помимо подложек с регулярным расположением лунок (в вершинах шестиугольника, HEX, или квадрата, SQ), были также исследованы поверхности с разной степенью разупорядоченности: лунки располагались в пределах 20 нм от вершин правильных квадратов (DSQ20), в пределах 50 нм (DSQ50) или же были нанесены случайным образом (RAND).

В первой серии экспериментов было изучено поведение человеческих остеогенных клеток на таких подложках in vitro. Чтобы оценить эффективность образования внеклеточного матрикса кости, препараты на 21-й день были обработаны антителами к остеопонтину и остеокальцину. Эти белки являются тканеспецифичными внеклеточными компонентами кости. Результат такого эксперимента представлен на рисунке 1. Как оказалось, на подложке с несколько разупорядоченным расположением лунок клетки достигают достаточной плотности и лучше всего синтезируют остеопонтин и остеокальцин. Более того, в этих препаратах было отмечено появление островков окостенения (bone nodule), что является важным этапом в процессе нормального формирования кости.



Рисунок 1. Остеогенные клетки. В вернем ряду приведены изображения подложек, полученных EBL. Второй и третий ряды: визуализация белков внеклеточного матрикса костной ткани (остеопонтина и остеокальцина, соответственно) методом иммунофлуоресценции (окрашено зеленым). Красным окрашен актин – белок, присутствующий во всех клетках и позволяющий оценить их форму и количество. а, f – контроль (клетки, выращенные на ровной подложке из PMMA). b, g –подложка HEX, обратите внимание на существенно меньшее количество клеток. c, h – подложка SQ. d, i – DSQ50; на такой подложке получен наилучший результат: видно присутствие остеопонтина, остеокальцина и формирование островка окостенения. e, j – RAND.

Однако гораздо интереснее знать, как поведут себя мезенхимальные стволовые клетки и будут ли они дифференцироваться в остеогенные клетки. Поэтому в следующей серии экспериментов исследователи изучили влияние наноструктурированных подложек на развитие МСК. Как и прежде, препараты окрашивали антителами к специфичным белкам внеклеточного матрикса кости (остеопонтину и остеокальцину); кроме того, их окрасили ализарином, чтобы проследить за минерализацией матрикса. Результаты представлены на рисунке 2. Снова оказалось, что наилучшее развитие костной ткани наблюдается на подложке с углублениями, расположенными в пределах 50 нм от вершин правильных квадратов.



Рисунок 2. МСК. В вернем ряду: изображения подложек. Второй и третий ряды: визуализация белков методом иммунофлуоресценции. Зеленым окрашены остеопонтин и остеокальцин, соответственно, красным – актин. a, f – контроль; обратите внимание, что клетки имеют морфологию фибробластов: они вытянуты преимущественно в одном направлении. b, g – на подложке SQ наблюдается аналогичная картина. c, h – на подложке с несколько разупорядоченными лунками, DSQ20, клетки имеют звездчатую форму, характерную для остеобластов. d, i – наилучший результат достигнут на подложке DSQ50. Видна характерная звездчатая форма клеток, присутствие остеопонтина и остеокальцина, появление островков окостенения. e, j – на подложке с беспорядочно расположенными лунками не видно ничего хорошего. k, l – микрофотографии в светлом поле/фазовый контраст. Препараты окрашены ализарином. Видно, что в контроле клетки имеют морфологию фибробластов, тогда как клетки, выращенные на подложке DSQ50, сформировали зрелый островок окостенения с участками минерализации (отмечено стрелкой).

Ученые не остановились на достигнутом. Для дальнейших исследований была выбрана подложка, показавшая наилучшие результаты в предыдущих опытах – DSQ50. Чтобы оценить, насколько полученные популяции клеток похожи на настоящую костную ткань, был изучен профиль экспрессии генов этих клеток. В качестве положительного контроля использовали клетки, выращенные на ровной подложке, однако обработанные индуктором формирования костной ткани – кортикостероидом дексаметазоном (DEX). Принято считать, что при обработке DEX клетки формируют костную ткань. В качестве отрицательного контроля взяли клетки, выращенные на ровной подложке без какой-либо дополнительной обработки. Оказалось, что профиль экспрессии генов довольно близок к положительному контролю, хотя в некоторых деталях и отличается от него. Однако по крайней мере часть отличий вызвана влиянием DEX на стероидные рецепторы и не связана с развитием костной ткани.

На основании проделанных экспериментов ученые заключают, что нашли способ выращивать клетки костной ткани без применения химических воздействий. Несомненно, это важный шаг в области тканевой инженерии кости.

Работа «The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder» опубликована в «Nature Materials». doi:10.1038/nmat2013

«Нанометр»