Трансгенные растения для фармакологии

20.03.2007123902

Е.Б. Рукавцова, Я.И. Бурьянов, Н.Я. Шульга, В.А. Быков


Лаборатория биотехнологии растений (зав. – проф. Я.И. Бурьянов) Филиала Института биоорганической химии РАН (дир. – акад. В.Т. Иванов), Пущино,
Отдел биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского Института лекарственных и ароматических растений (дир. – акад. РАМН В.А. Быков)


Опубликовано в журнале «Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии» 2006. № 2. С. 3-12.


С момента публикации в 1983 г. первых работ по получению трансгенных растений табака генетическая инженерия растений прошла стремительный путь развития как в фундаментальных, так и в прикладных научных направлениях.


В настоящее время практическая генноинженерная биотехнология развивается по двум основным направлениям. Первое направление, получившее неудачное название «молекулярная селекция» (molecular breeding), специализируется на решении новыми методами традиционных селекционно-генетических проблем повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и их защиты от различных биотических и абиотических стрессовых факторов. Второе направление, названное «молекулярным производством» (molecular farming), специализируется на получении и использовании трансгенных растений в качестве биореакторов, продуцирующих ценные для промышленности и медицины органические соединения.


В данном обзоре мы рассмотрим основные тенденции развития исследований по получению трансгенных растений для фармакологии, а также обсудим проблемы и перспективы их внедрения в современное производство.


Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений животных и человека», а также гранта РФФИ № 05-08-01473.


Метаболическая инженерия растений


Метаболическая инженерия направлена на проведение трансгенной клеткой новых биохимических реакций. Эти реакции детерминируют ферменты, кодируемые чужеродными генами или собственными модифицированными генами. Растения представляют один из наиболее привлекательных объектов для метаболической инженерии. Имея одинаковые пути синтеза основных биологических соединений, растения отличаются поразительным разнообразием своих конечных продуктов: сахаров, ароматических соединений, жирных кислот, стероидных соединений и других биологически активных веществ. Растения дают человечеству десятки тысяч природных продуктов, многие из которых представляют большую ценность для фармакологии и промышленности.


Часто такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые продуценты важных биологически активных веществ.


Многие растения содержат предшественники биосинтеза ценных биологических соединений, однако они не имеют ферментов для их превращений в эти соединения. Часто для целей метаболической инженерии достаточно переноса в клетку только одного гена. Примером такого типа метаболической инженерии является получение новых растений – продуцентов скополамина. Скополамин, как и атропин, является антихолинэргическим лекарственным веществом. Перенос гена гиосциамин-6-b-гидроксилазы из белены (Hyoscyamus niger) в растения красавки (Atropa belladonna) превратил продуцент атропина в продуцент скополамина. Указанный фермент катализирует реакцию превращения рацематной смеси алкалоидов гиосциамина (атропин) в 6-b-оксигиосциамин с последующей его 6,7-эпоксидацией в скополамин [167].


Такая же логика была использована при переносе гена стилбенсинтазы винограда в клетки табака [47]. Стилбенсинтаза катализирует реакцию синтеза резвератрола из трех молекул малонил-СоА и одной молекулы 4-кумарил-СоА, соединений, присутствующих в клетках любых растений (рис. 2). Получены растения, синтезирующие резвератрол.


Резвератрол является мощным антиоксидантом, блокирует свободнорадикальные реакции в организме, замедляет процессы старения и преждевременное увядание, оказывает разностороннее противоопухолевое действие, напрямую блокируя размножение опухолевых клеток. Резвератрол по своей структуре напоминает женский половой гормон и проявляет эстрогенную активность. Как и все фитоэстрогены, резвератрол уменьшает риск развития остеопороза, способствует омоложению кожи. Интересно отметить, что резвератрол является также растительным антибиотиком, фитоалексином, олигомерная форма которого, винеферин, токсична для фитопатогенных грибов. Получение овощных и плодовых растений с повышенным содержанием резвератрола можно рассматривать в качестве лечебных диетических продуктов с натуральной биологически активной добавкой. Для целей метаболической инженерии перспективно применение стратегии антисмысловых РНК (РНК-интерференции) [3].


Создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами


В настоящее время не вызывает сомнений, что многие продукты, потребляемые с фруктами, овощами и злаками, могут проявлять фармакологические эффекты и блокировать развитие сердечно-сосудистых, раковых и других заболеваний. К таким природным соединениям растений относятся сульфорафан из брокколи, резвератрол из винограда, генистеин из сои, эпигаллокатехин-3-галлат из зеленого чая [26].


Ранее было практически невозможно с помощью селекции создать растения с повышенным содержанием витаминов. Однако с развитием биохимии растений стало более ясным, какие метаболические пути являются критическими для биосинтеза витаминов. Например, для синтеза β-каротина (провитамина А) в растениях необходима фитоен-синтетаза. Этот фермент участвует в конденсации двух молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса [18]. Таким образом, получен «золотой рис», который может помочь 2 млрд. человек, страдающих от дефицита витамина А, для которых рис – основная пища. Получены трансгенные растения рапса (канолы), экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значительно повысилось содержание каротиноидов [125]. Показана экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина [41].


Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным синтезом L-аскорбиновой кислоты [7]. Эти растения отличались суперэкспрессией гена НАДФ-зависимой Д-галактуронат-редуктазы (GalUR). Созданы растения сои с повышенным в пять раз содержанием витамина Е в семенах [149]. Получены растения арабидопсиса с повышенным содержанием фолатов за счет экспрессии в них бактериального гена ГТФ-циклогидролазы-1 (EcGCH) [60].


Конструирование трансгенных растений – продуцентов целевых белков


Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Растительные системы имеют перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе.


Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях


Первым фармацевтически значимым белком, экспрессированным в растениях табака и подсолнечника в 1986 г., явился человеческий гормон роста [13]. С тех пор множество других ценных белков были синтезированы в самых различных растениях (табл.1).


Среди разнообразия рекомбинантных белков, продуцируемых растениями есть белки, используемые в молекулярно-биологических исследованиях (авидин [57]), молочные белки, используемые в качестве пищевых добавок (казеин [30]) и белки-полимеры для медицинских и промышленных целей (коллаген [99] и эластин[123]). Ценные биологически активные пептиды можно получать, встраивая их в состав запасных белков семян. Так, последовательность ДНК, кодирующая пентапептидный нейрогормон животных лейэнкефалин была встроена в ген 2S альбумина запасного белка семян Arabidopsis thaliana. Экспрессия этого гена в трансформированных растениях рапса и арабидопсиса позволила получить их семена с высоким содержанием рекомбинантного белка. Целевой пептид легко выделялся из рекомбинантного белка с помощью специфического протеолитического расщепления [148].


Примеры фармацевтически ценных белков, синтезируемых трансгенными растениями, приведены в табл.1. Многие из этих белков представляют собой продукты крови человека, такие как человеческий сывороточный альбумин (годовое производство более 500 тонн), цитокины и другие сигнальные молекулы.


Таблица 1. Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями



















































































































Белок Область применения Растение Источники
Соматотропин Гормон роста Табак, подсолнечник [13, 81, 130]
Энкефалины Передозировка наркотических веществ Табак [148]
Человеческий сывороточный альбумин Цирроз печени, ожоги, хирургия Табак, картофель [46, 126]
Эпидермальный фактор роста Стимуляция роста клеток кожи и роговицы Табак [56]
α-Трихосантин Терапия СПИДа Nicotiana bethamiana [71]
α-Интерферон Гепатиты В и С, опоясывающий лишай, вирусные бородавки Рис, турнепс, картофель [39, 105, 122, 163]
β-Интерферон То же Табак [43]
γ-Интерферон Хронический грануломатоз, лейшманиоз, лепра Табак [78]
Интерлейкины IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-18 Лейшманиоз, адъюванты Табак, картофель [52, 73, 87, 98, 107, 160]
Эритропоэтин Анемия Табак [27, 94]
Гирудин Ингибитор тромбина Рапс [108]
Глюкоцереброзидаза Болезнь Гоше Табак [32]
α,β-Гемоглобин Заменитель крови Табак [40]
β-Казеин Пищевая добавка Картофель [30]
Авидин, стрептавидин Биотин-связывающие белки Картофель, томаты, кукуруза [57, 102]
Гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор Антираковая терапия Табак [79]
α,β-Лактальбумин Пищевая добавка Табак, кукуруза [137, 166]
Апротинин Ингибитор трипсина при трансплантации Кукуруза [162]
α1-Антитрипсин Ингибитор протеаз, заболевания печени Рис [138, 144]
Коллаген Заживление ран Табак [99, 119]
Лактоферрин Бактериальные инфекции Картофель [33, 115]
Кальмодулин Активатор белков Табак [37]
TNF-α Фактор некроза опухолей Картофель [105]
Трипсин Расщепление белков Кукуруза [158]
Рицин В адъювант Табак [97]
Лизоцим Инфекционные заболевания Рис [54, 164]
Эластин Восстановление повреждённых сухожилий, стенок сосудов Табак, картофель [123]

До недавнего времени большинство белков экспрессировали в трансгенном табаке и экстрагировали из листьев. В основном, эти белки синтезировались на низком уровне, обычно менее 0.1% от растворимого белка клеток. В последние годы стали использовать другие системы трансформации и экспрессии, позволяющие нарабатывать белки в больших количествах. Более высокие уровни экспрессии получены в различных растениях с помощью обычной агробактериальной трансформации. Так гирудин, слитый с олеозином (белком из масляных телец), в семенах трансгенной канолы экспрессировался на уровне 0.3% [101, 108]. Трансформация хлоропластов геном человеческого гормона роста давала уровень экспрессии до 7%, а геном человеческого сывороточного альбумина – более 11% от растворимого белка клеток [130, 146].


Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями, уже производятся некоторыми западными компаниями или будут выпущены на рынок в ближайшие 5 лет. Например, авидин, трипсин и β-глюкуронидаза, выделяемые из трансгенной кукурузы, производятся фирмой Sigma-Aldrich (США). В скором времени должны быть подготовлены к промышленному производству коллаген, липаза, лактоферрин, лизоцим, синтезируемые трансгенными растениями [59]. Следует отметить перспективность получения модифицированных растений, экспрессирующих новые формы антимикробных пептидов [1].


Экспрессия рекомбинантных антител в трансгенных растениях


В 1989 г. Хиаттом с соавторами впервые достигнута экспрессия антител в растениях табака [55]. Таким образом, было показано, что растения могут собирать сложные функциональные гликопротеины, состоящие из нескольких субъединиц. Типичные антитела представляют собой тетрамеры из двух идентичных тяжелых и двух легких цепей, однако есть более сложные формы, например секреторные антитела, представляющие собой димеры обычных антител и включающие две дополнительные полипептидные цепи. Если у животных для сборки таких антител нужны два типа клеток, то у растений эта сборка антител проходит в одной клетке. Для этого получено четыре различных типа трансгенных растений, синтезирующих отдельные цепи иммуноглобулинов. Скрещивание между этими трансформантами дало потомство, способное к сборке антител в одной клетке. Такие антитела обладали иммуногенностью, они накапливались в клетках в количестве до 1,3% от суммарного растворимого белка [23].


Кроме полноразмерных иммуноглобулинов в растениях успешно синтезированы разные их производные: Fab-фрагменты (fragment antigen binding), одноцепочечные вариабельные фрагменты (single-chain variable fragment, scFv), биспецифичные вариабельные фрагменты [58, 66, 95, 151]. Данные о синтезе некоторых антител трансгенными растениями приведены в табл.2.


Таблица 2. Антитела, синтезируемые трансгенными растениями



















































































Применение Антиген Тип антител Растение Уровень экспрессии Источники
Онкология (рак кишечника, легких, опухоли эпителиального происхождения Раково-эмбриональный антиген человека Мышино-человеческие химерные антитела IgG1 (cT84.66), scFv T84.66, T84.66/G68 табак 1-12 мг/кг СВ [150, 151]
scFvT84.66 пшеница 50-900 нг/г СВ [131]
рис 1.5-29 мкг/г СВ
Нейтрализация вируса бешенства Белок вируса бешенства Моноклональные антитела mAb SO57 табак 3 мкг/г СВ
0.07% РБ
[69]
ИФА-диагностика Антитела против человеческого IgG C5-1 IgG люцерна 0.13-1.0% РБ [67]
Предотвращение зубного кариеса Поверхностный антиген стрептококка SAI/II Guy’s 13 IgG
IgA/G
sIgA/G
табак 200-500 мкг/г СВ
5-8% РБ
[76, 83-85]
Терапия рака толстой кишки Поверхностный антиген CO-17 A IgG Nicotiana benthamiana Нет данных [152]
Лечение герпеса типа 2 Белок вируса герпеса HSV-2 IgG, IgA, DigA
или sIgA IgG1 Fab и F(ab′)2
рис, соя Нет данных [16, 159]
Болезни сердца, митохондриальные нарушения, миопатии, ревматизм и другие болезни, связанные с повышенным или уменьшенным уровнем креатинкиназы Креатинкиназа человека MAK33 IgG1 арабидопсис 0.02-0.4% РБ листьев
(10-12% РБ межклеточной жидкости)
[38]
Fab-фрагмент арабидопсис 1.3% РБ [36]
табак 0.044% РБ
MAK33 scFv табак 6-55 нг/мг РБ [17]
MAK33 Fab-фрагмент арабидопсис 6.53% РБ
(0.02% РБ семян)
[109]
Лечение B-клеточной лимфомы Поверхностный Ig опухоли 38C13 scFv Nicotiana benthamiana 60 мкг/мл РБ межклеточной жидкости [95]
Иммуноаффинная очистка рекомбинантного HBsAg Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) scFv табак 0.031%-0.22% РБ [113, 114, 147]

(РБ – растворимый белок; СВ – сырой вес)


Антитела, полученные в растениях, могут быть одними из первых фармакологических белков, нарабатываемых в промышленных масштабах. Во многих исследованиях антитела получают в семенах злаковых и бобовых растений, что дает преимущество при их долговременном хранении при обычной температуре без потери активности. В семенах ячменя содержание диагностических антител достигало 150 мг/г веса семян [124]. Из многих бобовых только горох и соя используются в настоящее время в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Хотя соя дает сравнительно небольшой урожай по сравнению с кукурузой и рисом, содержание белка в семенах сои очень высокое – свыше 40%. Описан синтез человеческих антител к вирусу генитального герпеса в листьях и семенах сои [159]. Горох дает такой же урожай, как и соя и содержание белка в его семенах такое же, однако цена его выращивания на 50% выше. В горохе были экспрессированы одноцепочечные антитела. Одни из таких антител против ракового антигена синтезировались на низком уровне под контролем семяспецифичного легуминового А-промотора [110]. Другие антитела экспрессировались под семенным промотором USP и их синтез достигал 2% от общего белка семян [120]. Семяспецифичный промотор фасоли был использован для экспрессии одноцепочечных антител в Arabidopsis thaliana. По сравнению с промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), экспрессия под контролем которого составила до 1% от растворимого белка, промотор фасоли arc5-I дал выход антител до 36% от растворимого белка в семенах арабидопсиса, причем антитела сохраняли антиген-связывающую активность и аффинность [35].


Кроме того, антитела в растениях были получены методом агроинфильтрации [150, 151], а также с использованием векторов на основе вирусов [20, 88]. Преимущества этих двух систем в том, что можно получить миллиграммы белка за несколько дней вместо нескольких месяцев, которые требуются для получения трансгенных либо транспластомных линий растений.


Различия в гликозилировании у растений и животных могут быть важны при использовании в медицине антител, синтезированных в растениях. У растений гликопротеины имеют два углеводных остатка, не встречающихся у млекопитающих – β(1,2)-ксилозу и α(1,3)-фукозу Общая схема гликозилирования белков в клетках животных и растений показана на рис.3 [19].



Возможно, эти олигосахаридные остатки могут стать аллергенами для человека, поскольку в крови подопытных животных обнаруживались специфические иммуноглобулины IgE против растительных углеводных детерминант [45], хотя в недавних экспериментах на мышах этот результат не подтверждается [24]. В животных клетках ключевым ферментом, превращающим N-гликаны растений в N-гликаны млекопитающих, является β(1,4)-галактозилтрансфераза. Было проведено скрещивание трансгенных растений табака, синтезирующих этот фермент, с растениями – продуцентами тяжелой и легкой цепей антител [36]. У полученного потомства, содержащего все три белка, до 30% иммуноглобулинов имели галактозилированные N-гликаны.


Многие рекомбинантные антитела, первоначально синтезируемые в растениях, секретировались в апопласт. Однако не так давно показано, что для усиления стабильности антител необходимо использовать сигнальный лидерный пептид и С-концевой сигнал KDEL (лизин-аспартат-глутамат-лейцин) для удерживания в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [31, 112, 154], а также для предотвращения добавления к антителам иммуногенных N-гликанов. Белки растений, связанные с ЭПР, содержат N-гликаны маннозного типа [106], являющиеся обычными и для животных и поэтому, они не должны быть иммуногенны. Недавно показано, что химерные мышино-человеческие антитела, имеющие KDEL-сигнал на легкой и тяжелой цепи, собирались в функциональную форму H2L2, и содержали 6-9 остатков маннозы [129, 145].


В последнее время проводятся эксперименты по изменению гликозилирования белков человека в трансгенных растениях. Вероятно, эта проблема будет решена тем или иным путем и антитела, синтезированные в растениях, будут широко использоваться в медицине.


Одним из первых продуктов на основе трансгенных растений табака, подготовленным к крупномасштабному производству, является препарат CaroRx, представляющий собой секреторные антитела IgA против Streptococcus mutans – основного возбудителя кариеса [76]. Эти антитела при нанесении их на зубы добровольцев оказались очень эффективными и предотвращали повторное заражение S. mutans на период до двух лет. Другие моноклональные антитела, экспрессированные в сое – антитела против генитального герпеса, могут также быть внедрены в производство [159]. Эти антитела, несмотря на различие в гликозилировании, защищали мышей от вируса герпеса типа 2 так же хорошо, как и антитела, синтезированные в культуре клеток человека. Еще одни антитела, прошедшие фазу I клинических испытаний – scFv-антитела против лимфомы [95].


Имеется ряд сообщений об успешном синтезе в растениях и в суспензионных клетках растений мини-антител [5].


Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях


Впервые структурная идентичность и иммуногенность антигена, синтезированного в растениях, была подтверждена в 1992 г., когда были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) [90]. В дальнейшем теми же исследователями был показан иммунный ответ у мышей, вакцинированных антигеном, выделенным из листьев табака [139]. Кроме того, получены растения картофеля и суспензионные культуры табака и сои, где антиген экспрессировался на уровне до 1700 мкг/г сухого веса [116, 128]. Показано, что HBs-антиген, синтезируемый растениями картофеля, вызывал у мышей более сильный иммунный ответ, чем продуцируемый дрожжами [70]. Проведены испытания вакцины на основе трансгенного картофеля на добровольцах и показана ее иммуногенность при оральном введении [140].


Нами получены растения табака, экспрессирующие рекомбинантный ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты [2, 4]. Использование двойного промотора 35S увеличило синтез антигена до 0.05% от суммарного растворимого белка. Получены также трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем этого же промотора и промотора гена пататина клубней картофеля. Содержание HBs-антигена в клубнях картофеля достигало более 1 мкг/г массы клубня и было максимальным в растениях, экспрессирующих ген НВsАg под контролем двойного промотора CaMV 35SS. Проведена очистка и аналитическая гельфильтрация HBs-антигена из трансгенных растений, показавшая, что продукт экспрессии гена HBsAg образует мультимерные формы и в агрегации HBs-мономеров в иммуногенные мультимеры участвует не менее 70-80 молекул мономеров [6].


К настоящему времени имеются публикации по синтезу более 50 различных человеческих и животных антигенов в трансгенных растениях. Некоторые данные по этим растениям приведены в табл.3.


Таблица 3. Субъединичные вакцины, синтезируемые трансгенными растениями

























































































































Белок Растение Уровень экспрессии Источники
Поверхностный антиген оболочки вируса гепатита В (HBsAg) табак 0.001-0.05% РБ листьев [2, 4, 6, 44, 49, 64, 72, 82, 90, 116, 128, 139]
картофель до 10 мкг/г СВ клубней
люпин 150 нг/г СВ каллуса
cалат 1-5.5 нг/г СВ листьев
физалис 10 нг/г СВ плодов
бананы 38 нг/г СВ листьев
Эпитоп HVR1 вируса гепатита С, слитый с CTB табак Нет данных [103]
Белок HEV-E2 вируса гепатита Е томаты 50-60 нг/г СВ [86]
В-субъединица термолабильного токсина LT-B из энтеротоксичного штамма E.coli табак <0.01% РБ
2.5% РБ хлоропластов
[29, 53, 63, 77, 92, 133, 135]
картофель 3.7-15.7 мкг/г СВ клубней
кукуруза 8.7% белка эндосперма
В-субъединица холерного токсина СT-B картофель 0.3% РБ [8, 9, 34, 62]
табак 4.1% РБ хлоропластов
томат 0.02-0.04% РБ
Белок капсида вируса гастроэнтерита человека Norwalk (NVCP) табак 0.23% РБ [91, 136]
картофель <0.37% РБ
Гликопротеин вируса бешенства томат 1.00% РБ [96]
Антиген DRg24 вируса бешенства табак, шпинат Нет данных [100, 168, 169]
Гликопротеин S вируса гастроэнтерита свиней (TGEV) арабидопсис 0.07% РБ [51, 75, 146]
табак 0.02% РБ
кукуруза <0.01% СВ
Антиген сибиреязвенной палочки табак Нет данных [11]
G-белок вируса RSV табак Нет данных [14]
F-белок вируса RSV томат до 32.5 мкг/г СВ плодов [121]
Гликопротеин В цитомегаловируса человека табак <0.02 РБ [134]
Гемагглютинин вируса кори (MV-H) морковь, табак Нет данных [15, 61, 156]
Белки вируса папилломы человека (L1) Nicotiana benthamiana картофель 0.2-0.5% РБ [48, 155]
Столбнячный токсин TetC табак 10-25% РБ хлоропластов [24, 141-143]
Белок VP1 вируса ящура арабидопсис, люцерна, картофель Нет данных [21, 22, 42]
S1-белок коронавируса атипичной пневмонии табак, томаты Нет данных [111]
Капсидный белок p24 вируса HIV-1 табак 0.35% РБ [162]
Белок Tat вируса HIV-1 картофель 0.0015% РБ [65, 68]
шпинат 0.03% СВ
Белок оболочки вируса HIV-1 (gp41) Nicotiana benthamiana Нет данных [89, 93]
Туберкулезный антиген ESAT-6, слитый с LTB арабидопсис 11-25 мкг/г СВ [117, 118]

(РБ – растворимый белок; СВ – сырой вес)


В настоящее время интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу. В случае успеха отпадает потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима при создании вакцин для парентерального введения [153]. Различные субъединичные вакцины экспрессированы в растениях и для многих из них показана иммуногенность при оральном введении людям и животным [9, 132, 135, 136, 157]. Антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета.


Две вакцины, синтезируемые в растениях картофеля уже прошли стадию клинических испытаний – это субъединица В термолабильного токсина (LT-B) энтеротоксигенного штамма E.coli (ETEC) и капсидный белок вируса Норфолк (NVCP) [135, 136]. Эти антигены, выделенные из двух важных кишечных патогенов, могут быть идеальными съедобными вакцинами, поскольку оба имеют мультимерную структуру и устойчивы к перевариванию в кишечнике человека. Каждый из этих белков накапливался в больших количествах в клубнях картофеля и правильно собирался в олигомеры. Клинические испытания рекомбинантной вакцины LT-B показали, что поедание добровольцами сырых клубней картофеля, содержащих 0.3-10 мг LT-B, приводило к образованию мукозных и системных антител с высокими титрами [135]. Значительный прогресс достигнут в использовании семян кукурузы для экспрессии съедобных вакцин [28, 29, 133]. Субъединица LT-B экспрессировалась в семенах на уровне до 0.1% от сырого веса и обладала иммуногенными и защитными свойствами при поедании мышами. Ассоциация с крахмалом облегчает очистку антигена из зерен кукурузы, и кроме того обеспечивает термостабильность антигена и его устойчивость к протеолитической деградации при попадании в желудочно-кишечный тракт. Последнее обстоятельство важно при оральном введении антигена. На основе семян кукурузы создана вакцина, защищающая свиней от вирусного гастроэнтерита [74, 75]. Уровень экспрессии белка для создания съедобных вакцин должен быть достаточно высок. Этого можно достичь, например, при трансформации пластид, что дает до 25% целевого белка от общего растворимого белка клеток [141, 142].


Иногда антигены сшивают с другими белками для облегчения детекции, например, с геном β-глюкуронидазы (GUS). По GUS-активности мохно легко определить уровень экспрессии антигенов в трансформантах [42, 50]. В обоих случаях белки сохраняли свою иммуногенность.


Субъединицу холерного токсина (CTB) эффективно используют для сшивки с другими белками-антигенами и последующей трансформации растений. Например, была описана экспрессия эпитопа HVR1 вируса гепатита С, сшитого с CTB, на основе вируса табачной мозаики [103]. Растения табака, инокулированные этим вирусом, синтезировали функциональный белок CTB-HVR1, реагирующий с моноклональными антителами против HVR1, а также с сывороткой крови людей, инфицированных вирусом гепатита С. Другие исследователи сшили эпитоп ротавирусного энтеротоксина NSP4 с CTB и трансформировали полученной конструкцией картофель [10]. Эта работа была продолжена созданием мультикомпонентной вакцины, состоявшей из белка NSP4-CTB и фимбриального антигена из энтеротоксичного штамма E. coli, слитого с субъединицей холерного токсина CTA2 [166]. Два этих белка собирались в структуры, подобные целому холерному токсину, и сохраняли способность связываться с рецепторами кишечника. У орально иммунизированных мышей вырабатывались антитела против патогенных антигенов, а также уменьшились симптомы диареи после заражения ротавирусом.


Стабильность антигенов, экспрессируемых в растениях, проверялась многими исследователями. Так, растения клевера, синтезирующие лейкотоксин Lkt-50 из Mannheimia haemolytica, сшитый с зеленым флуоресцентным белком GFP, были высушены при комнатной температуре и обычной влажности в течение 1-4 суток. Через 3 суток исходный вес листьев уменьшился на 80%, однако не было заметной деградации лейкотоксина и потери его иммуногенности. Исследователи пришли к выводу, что сшитый белок не требует низкой температуры для хранения [80]. Подробный анализ стабильности антигена HBsAg был предпринят Смитом с соавторами [127]. Определение количества HBsAg сильно зависело от концентрации детергента тритон Х-100 в экстракционном буфере. Добавление аскорбата натрия в концентрации 1-20% w/v повышало уровень антигена, реагирующего с моноклональными антителами, в 4-10 раз. Оптимальная концентрация детергента в буфере позволяла хранить выделенный из растений HBsAg до месяца без потери активности. Протеолиз антигена удалось предотвратить добавлением обезжиренного молока, в этом случае антиген мохно было хранить до двух месяцев. Эти исследования показали способ повышения иммуногенности и стабильности антигенов, синтезируемых трансгенными растениями. Лиофилизированные и измельченные в пудру клубни картофеля, синтезирующего белок VP60 вируса кроличьей геморрагической болезни, сохраняли его высокую иммуногенность после нескольких месяцев хранения [23].


Заключение


Генноинженерная биотехнология растений для фармакологии делает свои первые успешные практические шаги. Уже сейчас проявляется тенденция ее разделения на несколько специализированных направлений. Первое направление связано с созданием полевых растений, продуцирующих в крупном масштабе целевые биологически активные вещества. Однако такое крупномасштабное производство потребует неизмеримо меньше посевных площадей по сравнению с десятками миллионов гектаров, отводимых под сельскохозяйственные трансгенные растения. Так, при продуцировании картофелем вакциногенного целевого белка на уровне 0.5% от общего белка клетки, выходе очищенной субстанции на уровне 20% и суммарной дозе вакцины на уровне 100 мкг для взрослого человека, потребуется 10-15 га посевной площади при урожайности 0.5 т/га для вакцинирования 100 млн. человек. В этой связи возрастают возможности контроля над такими трансгенными растениями, удовлетворяющие всем эколого-биологическим требованиям, предъявляемым к трансгенным растениям, культивируемым в окружающей среде. Такие растения могут быть лишены генов устойчивости к гербицидам, фитопатогенам и вредителям, вызывающих риск их передачи другим растениям. Следует также отметить, что экономические затраты на культивирование таких растений будут минимальными.


Второе направление связано с развитием биотехнологии культуры трансгенных клеток и тканей растений, синтезирующих ценные биологически активные соединения [5]. Эта биотехнология создает условия стандартизации процесса культивирования, необходимые в случаях биосинтеза определенных биологически активных соединений и удовлетворяет международным производственным стандартам GMP. Промежуточное направление связано с использованием методов вирусной инфекции целых растений, культивируемых в изолированных условиях [20, 88], а также агроинфильтрации [150, 151].


В настоящее время описано получение многих видов трансгенных растений, синтезирующих белки, ценные для фармакологии и медицины. Эти виды включают как лабораторные модельные растения (табак, арабидопсис), так и традиционные сельскохозяйственные культуры: злаковые (рис, пшеница, кукуруза) и плодово-овощные культуры (томаты, бананы, картофель). Эффективность экспрессии определенных белков под контролем различных регуляторно-промоторных элементов может зависеть от выбора конкретного растения-продуцента. По-видимому, в ближайшем будущем будут разработаны различные специализированные системы продукции белков фармацевтического назначения: «растение (орган, ткань) – ген целевого белка – регуляторные элементы генетической экспрессии». Для биосинтеза низкомолекулярных биологически активных вешеств выбор растений-продуцентов будет определяться присутствием и количественным содержанием конкретных вторичных метаболитов – субстратов для проведения целевой энзиматической реакции. Выбор растения-продуцента биологически активных веществ фармацевтического назначения будет определяться и такими требованиями как экономичность, затраты на культивирование растений и их хранение, легкость выделения из них целевых белков.


Таким образом, можно с уверенностью заключить, что трансгенные растения имеют все перспективы стать безопасными и экономически выгодными системами для получения разнообразных биологически активных веществ для фармакологии.


Приложение: список литературы к статье «Трансгенные растения для фармакологии»



Комментарии к статье:
14.03.2016
dcemko: К статье, к сожалению, не видно списка литературы
14.03.2016
Maria: Статья очень старая, некоторая информация из старых статей, в том числе, таблицы, изображения и гиперссылки не сохранились при переносе сайта.
Ваш комментарий:
Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии. Чтобы оставить комментарий, необходимо авторизоваться.
Вернуться к списку статей